Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.
Telomer dysfunktion-inducerad förlust av genomet integritet och dess tillhörande DNA-skador signalering och checkpoint svar är väletablerade förare som orsakar vävnadsdegeneration under åldrandet. Cancer, med incidens kraftigt öka med åldern, kännetecknas av korta telomerlängden och hög telomerasaktivitet. Att studera roller telomer dysfunktion och telomeras reaktive i åldrande och cancer, visar protokollet hur man skapar två murina inducerbart telomeras knock-in alleler 4-hydroxitamoxifen (4-OHT) -inducerbara TERT-östrogenreceptor (mTERT-ER) och Lox -Stopper-Lox TERT (LSL-mTERT). Protokollet beskriver förfaranden för att inducera telomer dysfunktion och återaktivera telomerasaktivitet i mTERT-ER och LSL-mTERT möss in vivo. De representativa data visar att reaktivering av telomeras-aktivitet kan lindra vävnads degenerativa fenotyper inducerade av telomer dysfunktion. I Order för att bedöma effekten av telomeras reaktive på tumorigenes genererade vi prostatatumörmodell G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L och tymisk T-cellslymfom modell G4 Atm – / – mTERT ER / ER . De representativa data visar att telomeras reaktive i bakgrunden av genomisk instabilitet induceras av telomer dysfunktion kan avsevärt förbättra tumörbildning. Protokollet beskriver också de förfaranden som används för att isolera neurala stamceller (NSCs) från mTERT-ER och LSL-mTERT möss och återaktivera telomerasaktivitet i NSCs in vitro. De representativa data visar att reaktivering av telomeras kan öka självförnyelse kapacitet och neurogenes in vitro. Slutligen beskriver protokollet förfarandena för att utföra telomer FISH (fluorescens in situ hybridisering) på både mus FFPE (Formalin Fasta och Paraffena Embedded) hjärnvävnader och metafaskromosomer av odlade celler.
Telomeras är ett enzym som ansvarar för att upprätthålla telomerer. Dessa är repetitiva sekvenser vid ändarna av kromosomer som skyddar deras integritet. De centrala delarna av telomeras holoenzym är ett omvänt transkriptas katalytisk subenhet (TERT) och en RNA subenhet (TERC) som fungerar som mall för att lägga till telomera upprepar 1,2. Medan generellt undertryckt i differentierade somatiska celler, uppvisar telomeras robust aktivitet och spelar viktiga roller i könsceller, cancerceller och stamceller.
mTERC och mTERT knockoutmöss ge stor in vivo modellsystem för att studera funktioner telomeras i både stamceller och cancer. Den mTERC och mTERT knockout möss (G1) visade inga uppenbara fenotyper grund av den långa reserv av telomererna hos möss 3. Men seriellt intercrossing mTERC och mTERT knockoutmöss till sen generationen (G5-G6) resulterade iprogressiv erosion av telomerer och så småningom provocerade allvarlig degeneration av mycket proliferativa vävnader fyra. Sen generationen (G5-G6) mTERC – / – möss är infertila på grund av de höga apoptos i testikel och könscell utarmning. G5-G6 mTERC – / – möss uppvisar också degenerativa fenotyper i mycket proliferativa vävnader inklusive benmärg, tarm och hud på grund av höga apoptos och defekt självförnyelse kapacitet i vävnads stam / progenitorceller fack 4. Hematopoetiska stamceller i benmärgen sen generationen mTERC – / – möss uppvisar förlust av proliferativ potential, äventyras självförnyelse kapacitet, förbättrad apoptos och slutligen funktionell utmattning 5,6. Likaså var progressivt ökade apoptotiska kroppar i tarm kryptor observerats i varje generation av G1-G6 mTERC – / – möss 7,8. THan skadlig effekt av dysfunktionella telomerer verkar inte vara begränsad till höga omsättnings vävnader eftersom både spridningen av vuxna neurala stamceller in vitro och neurogenes in vivo var allvarligt nedsatt sent generationen (G4-G5) mTERC – / – möss 9 . Roll telomeras i stamceller stöds också av resultaten i en sällsynt mänsklig genetisk sjukdom dyskeratosis congenita (DKC), som på vissa sätt liknar tidigt åldrande 10,11. DKC orsakas av mutationer i TERC, TERT, och gener som kodar dyskerin, en kärna telomeras subenhet, och övriga dyskerin associerade proteiner 12. I genomsnitt telomerer i DKC patienter är kortare än 99% av åldersmatchade kontroller. Den viktigaste morbiditet av sjukdomen beror på aplastisk anemi, som orsakas av felaktigt underhåll av hematopoietiska stamceller. Andra aspekter av sjukdomen såsom oral leukoplaki, spik dystrofi, mentala retardatipå, testiklar atrofi och lungkomplikationer alla föreslår nedsatt funktioner vävnads stamceller och progenitorceller 10, fynd i nära överensstämmelse med de i slutet generation telomeras knockoutmöss. DKC patienter är benägna att myelodysplastiskt syndrom och har en ökad förekomst av maligna tumörer slemhinnor. Således brist på telomeras i mänskliga patienter rekapitulerar de brister i stamcells funktioner och tumör anlag som observeras i slutet generationens telomeras knockoutmöss.
Korta telomerer och hög telomerasaktivitet är kännetecken för cancer. Som normala eller premaligna celler delar, de låga eller frånvarande telomeras-aktivitet leder till en eventuell urholkning av telomerer och aktivering av cellulära vägspärrar som liknar dem som framkallats av DNA dubbelsträngat-raster (DSB) 13. Liksom klassiska-DSB har telomer dysfunktion visats inducera p53 och associerade cellulära svar, såsom senescens och / eller apoptosis 14,15. Vid mutationsinaktivering av p53, är cell cykling och cellöverlevnad förbättras i celler med telomer dysfunktion, vilket ger en pro-cancerogena mutator mekanism som kännetecknas av translokationer och regionala förstärkningar och strykningar 16,17. Samtidigt fortsatte telomer dysfunktion och tillhörande skenande kromosomal instabilitet (även i p53 null-celler) förefaller begränsa fullt malign progression av sådana cancrar. Exempelvis sen generation G4-G5 mTERC – / – Ink4a / Arf – / – möss visade signifikant reducerad lymfom incidens jämfört med Ink4a / Arf null möss på grund av telomer attrition. I en annan studie, mer avancerade adenomatösa lesioner i G4 mTERT – / – APC min möss kraftigt undertryckt i jämförelse med APC min möss på grund av betydande tillväxt gripande och apoptos 18,19. Denobservationen att telomererna dysfunktion-inducerad genomisk instabilitet hämmar tumörprogression uppmanar spekulationer om att aktiveringen av telomeras kan möjliggöra malignt progression delvis av quelling genomisk instabilitet till en nivå som är förenlig med cancer cellviabilitet och / eller neutraliserande p53-beroende eller -oberoende checkpoint mekanismer.
För att studera om telomeras reaktive kan stoppa eller ens vända åldrande av stamceller, och om telomeras reaktive kan främja tumörbildning mot bakgrund av genomisk instabilitet, genererade vi två inducerbara murina telomeras alleler. Den första är 4-hydroxitamoxifen (4-OHT) -inducerbara TERT-östrogenreceptor (mTERT-ER) fusion knock-in allel. I avsaknad av 4-OHT, möss homozygota för mTERT-ER (betecknad mTERT ER / ER) är telomerasaktiviteten bristfällig och upprätthålla samma cytogenetiska och cellulära fenotyper som konventionell mTERT eller mTERC knockout modell. Vid 4-OHT behandling, kan TERT-ER proteinaktivitet återställas till nivåer som är jämförbara med de infödda TERT protein 20, 21. Den andra allelen är en roman inducerbart TERT knock-in allel innehåller en intronisk LoxP-Stopper-LoxP kassett (LSL- mTERT); upon Cre-medierad excision av LSL, mTERT åter uttrycks under endogena uttrycks kontrollmekanismer 22.
Här rapporterar vi generering av två inducerbara murina telomeras alleler och hur man återaktiverar telomeras in vivo och in vitro. Det kritiska steget för reaktive mTERT-ER-aktivitet är att hålla en kontinuerlig koncentration av tamoxifen, så vi väljer att använda 4-OHT tid frisättning pellets som tillverkas av Innovative Research of America. Pelletsen håller frigör 4OHT vid ett steady state blodnivå av en ng / ml i upp till 60 dagar. I en tidigare studie visade vi att reaktivera telomerasaktivitet med denna strategi kunde lindra degenerativa fenotyper såsom stamcells utmattning, nedsatt vävnadsskada svar och organsvikt i flera organ som induceras av telomer dysfunktion i G4 mTERT ER / ER möss 20.
Annat än att studera funktionen av telomeras i åldrandet, kan dessa två inducerbara telomeras alleler också användas för att studera cancer. Tidigare studier tognytta av dessa alleler att utforska roll telomer avgång och telomeras reaktive i utformningen genomen och påverkar biologi T-cellslymfom tymisk 21 och prostatacancer 22. Dessa två studier visade att telomer dysfunktion i slutet generation G4 Atm – / – mTERT ER / ER och G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L-möss ger en mekanism bränslepåfyllning förvärvet av tidiga mutagena händelser för tumör initiering, men förhindrar progression av fullt maligna tumörer. När telomeras reaktiverades i samband med telomer dysfunktion inducerad genomisk instabilitet, DNA-skadecheckpoints och skenande kromosomal instabilitet undertrycktes, vilket tillät den fullständiga utvecklingen av maligna tumörer med nya biologiska egenskaper såsom benmetastas av prostatacancer 21 och hjärna infiltration av Thymic lymfom 21. Liknande fenomen observerades också i andra typer av cancer, inklusive koloncancer och pankreascancer (personlig kommunikation med Drs. Haoqiang Ying, Adam Boutin och Ronald DePinho).
Eftersom TERT-ER protein kan lätt växlas mellan på och stater utanför beroende på om djuren behandlas med tamoxifen eller fordon, kan tumörmodeller som genereras av mTERT-ER-allelen användas för att testa anti telomeras terapi. I tidigare studie, tumörer som genereras i G4 Atm – / – mTERT ER / ER djuren släpptes från 4-OHT; på telomeras utarmning, krympte tumörer så småningom på grund av återinförande av telomeren dysfunktion-inducerade kontrollpunkter 21. Men för att en del av tumörerna förvärvat resistens som svar telomeras utplåning genom att aktivera en alternativ Förlängning av Telomerer (ALT) mekanism. Ytterligare karakterisering av dessa ALT + resistenta tumörer visade att thej har avvikande transkription av gener involverade i mitokondriell biologi och oxidativ försvar inklusive en mästare regulator av mitokondriell syntes och oxidativ försvar PGC-1β. Knockdown av PGC-1β eller SOD2 (en annan regulator av oxidativ försvar) eliminerar signifikant ALT + tumörceller medan hålla telomeras + tumörceller förblir relativt intakt 21.
En begränsning av dessa två knock-in alleler är att de bara har råd reaktivering av telomeras på endogen nivå eftersom de är i det nativa locuset av telomerasgenen. I de flesta mänskliga cancer är telomeras faktiskt överuttryckt på en mycket högre nivå. För att öka graden av telomeras, ett modifikation vi kan tänka på är att infoga mTERT-ER-konstruktion med en starkare promotor såsom PGK (fosfoglyceratkinas) promotor i ROSA26 locus.
Sammanfattningsvis dessa två nya inducerbara murina telomeras alleler ger oöverträffad genetic verktyg för att studera funktionen hos telomeras i åldrande och vävnads homeostas samt tumörprogression, särskilt under bakgrunden av pre-förvärvad telomer dysfunktion-inducerad genomisk instabilitet. Den mTERT-ER-allelen kan också användas för att studera anti telomeras terapi genom att korsa in andra tumörbenägna musmodeller.
The authors have nothing to disclose.
J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).
Leica AM6000 Micromanipulation Kit | Leica | Per quote | |
Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica | Per quote | |
Neomycin | Life technologies | 21810031 | |
isoflurane vaporizer | Veterinary Anesthesia Systems | 911103 | |
isoflurane | Henry Schein | 1005796 | |
ketamine-xylazine mixture | Sigma-Aldrich | K113-10ML | |
4-OHT powder | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | |
Tamoxfien | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
4-OHT pellet | Innovative Research of America | Custermized | |
Precision Trochar (10 Gauge) | Innovative Research of America | MP-182 | |
wound clip applier | Fischer Scientific | 01-804 | |
clip | Fischer Scientific | 01-804-5 | |
Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
HBSS | Life technologies | 14025092 | |
PBS | Life technologies | 10010023 | |
xylene | Fischer Scientific | X3P-1GAL | |
methanol | Fischer Scientific | A-433S4 | |
acetic acid | Fischer Scientific | A38-500 | |
ethanol | Fischer Scientific | 22-032-104 | |
formamide | Fischer Scientific | F84-1 | |
PNA telomere probe | Panagene | F1001-5 | |
PNA centromere probe | Panagene | F3003-5 | |
20X SSC | Fischer Scientific | BP1325-4 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
tRNA | Sigma-Aldrich | R5636-1ML | |
Tween 20 | Fischer Scientific | BP337-100 | |
rubber cement | Walmart | Elmer's | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |