Nós desenvolvemos uma hipocampo in vitro desdobrada que preserva CA1-CA3 matriz de neurónios. Combinada com a rede de micro-eléctrodo penetrante, actividade neuronal pode ser monitorizada em ambas as orientações longitudinais e transversais. Este método oferece vantagens em relação a preparações de fatias do hipocampo como a propagação em todo o hipocampo podem ser gravados simultaneamente.
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Artigo de método
Neural Activity Propagação em uma Unfolded Hippocampal Preparação com um penetrante Micro-eletrodo Matriz
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo descreve um método para a preparação de uma nova preparação de hipocampo in vitro fixa combinada com uma rede de micro-maquinado para mapear a actividade neuronal no hipocampo. A preparação transversal fatia do hipocampo é a preparação do tecido mais comum para estudar hipocampo eletrofisiologia. Uma fatia de hipocampo longitudinal também foi desenvolvido a fim de investigar as ligações longitudinais no hipocampo. Os hipocampo do rato também intactos podem ser mantidas in vitro, porque a sua espessura permite a difusão de oxigénio adequado. No entanto, estas três preparações não fornecem acesso direto a propagação neural já que alguns dos tecidos está ausente ou dobrado. O hipocampo intacto desdobrado fornece tanto transversais e longitudinais conexões em uma configuração plana para acesso direto ao tecido para analisar toda a extensão da propagação do sinal no hipocampo in vitro. A fim de controlar eficazmente a atividade neural de tele camada de células, um feito penetrar rede de micro-eléctrodo (PMEA) foi fabricado e aplicado ao hipocampo desdobrado. O PMEA com 64 eletrodos de 200 mm de altura poderia gravar a atividade neural profundo dentro do hipocampo do rato. A combinação única de uma preparação do hipocampo e desdobrada a PMEA fornece uma nova ferramenta in vitro para estudar a velocidade e direcção de propagação da actividade neural nas regiões bidimensionais CA1-CA3 do hipocampo, com uma alta relação sinal-ruído.
Introdução
Compreendendo a condução neural ou propagação de sinais neurais é crucial para a determinação do mecanismo da comunicação neuronal, tanto no funcionamento normal e em condições patológicas do cérebro 1-3. O hipocampo é uma das estruturas mais estudadas no cérebro, uma vez que desempenha papel fundamental em diversas funções cerebrais como memória, e rastreamento espacial e está envolvido em várias alterações patológicas que afetam drasticamente o comportamento bem 1,6. Embora, o hipocampo exibe uma organização complexa, os diferentes elementos da sua estrutura pode ser facilmente identificado e consultados na preparação fatia 4-6. No ....
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Protocolo
NOTA: Animal protocolos experimentais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional na universidade. Ratos CD1 de ambos os sexos com a idade de P10 a P20 são usadas neste estudo.
1. Soluções para Cirurgia Experimental e Gravação
- Preparar tampão normal de fluido cerebrospinal artificial (ACSF) contendo (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH 2 PO 4 1,25, MgSO4 2, NaHCO3 26, glicose 10, e CaCl 2 2. Utilizar esta ACSF normal para a recuperação do tecido após a dissecação, bem como para o sistema de lavagem no início da experiência.
- Prepare ACSF sacarose q....
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Resultados
Os dados mostrados nas figuras aqui foram registados na preparação hipocampo desdobrado com 4-AP (100 uM) aCSF adicionado durante a incubação do tecido na câmara de gravação à TA (25 ° C). Normalmente atividade começa dentro de 5 min, mas em alguns tecidos do hipocampo dos animais mais velhos pode demorar mais tempo. O disparo neuronal induzida por AP-4 observado com o PMEA é o mesmo que anteriormente relatado 14,15. Uma vez que os eléctrodos têm uma altura de 200 mm, as pontas dos eléctrodos estão localizado.......
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Discussão
O desenvolvimento do hipocampo preparação desdobrada, em que os eixos longitudinais e transversais do hipocampo são preservadas em combinação com uma matriz de microeléctrodos penetrante, fornece uma ferramenta poderosa para investigar as ligações anatomia ou propagação neural no hipocampo 7. Este procedimento de desdobramento é também aplicável para estudar hipocampo em ratos adultos. Estudos recentes com esta preparação mostrou que a actividade epileptiforme induzido-4-AP poderia propagar com uma frente de .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 e pela cadeira dotada de E.L. Lindseth para Dominique M. Durand. Agradecemos ao laboratório do Dr. Andrew M. Rollins pela ajuda na imagem da OCT.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| frasco dessecador | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Coloque toalhas de papel comuns no fundo do frasco para uso em anestesia animal. |
| Uma lâmina e um estágio cirúrgico feito pela Custome para desdobrar o hipocampo | N/ | A N/A | Uma placa de Petri é colocada de cabeça para baixo (no centro) no gelo com um papel de filtro úmido colocado em cima dela. |
| Câmara de recuperação de tecidos feita sob medida | N/A | N/A | Os tubos de plástico foram colados com malha plástica na parte inferior e borbulharam com 95% de O2/5% de CO2 no aCSF. |
| Operação Reta Tesoura | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | Esta tesoura é usada para decapitar os ratos. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Tesoura | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | Esta tesoura é usada para cortar o crânio dos ratos. |
| Fórceps de Histerectomia Miltex | Claflin Equipamento médico | CESS-722033-00001 | Este fórceps é usado para descascar o crânio cortado para expor o cérebro |
| Micro Espátula | Cardinal Health | Esta micro espátula é usada para transferir todo o cérebro de uma semiesfera para a câmara de reperfuração. | |
| Espátula Semi-Micro de Aço Inoxidável Frey Scientific | Cardinal Health | Esta espátula semi micro é usada para transferir o hipocampo desdobrado para a glicose aCSF na câmara de recuperação. | |
| pincel pequeno | Lowe's | tem #: 105657 Modelo #: 90219 | Aquele com o menor tamanho em um pacote de pincel normal |
| Ferramenta de ajuda de vidro polido a fogo | N / A | N / A | Esta ferramenta foi polida a fogo e feita a partir das pipetas de vidro Pasteur regulares. |
| Agulha de vidro feita sob medida | N/A | N/A | Esta ferramenta foi polida a fogo e feita a partir das pipetas de vidro Pasteur regulares. |
| Ferramenta de vidro feita sob medida com um laço de fio de metal | N/A | N/A | Esta ferramenta foi polida a fogo e feita a partir das pipetas de vidro Pasteur regulares com um laço de fio de metal remodelado. |
| Conta-gotas de solução de vidro feito sob medida | N/A | N/A | Esta ferramenta foi feita a partir das pipetas de vidro Pasteur regulares com suas pontas cortadas e uma cabeça de borracha anexada com a extremidade cortada. |
| Âncora de tecido personalizada | N / A | N / A | A Malha de fibra de nylon foi colada em um anel de fio de cobre isolado. A âncora de tecido foi segurada por um micromanipulador. |
| Matriz de microeletrodos fabricada sob medida | N/A | N/A | Mais detalhes sobre a matriz, consulte Kibler, et al, 2011. |
| Circuitos de filtro e amplificadores feitos sob medida para a matriz | N/A | N/A | Mais detalhes sobre a matriz, consulte Kibler, et al, 2011. |
| Processador de aquisição de dados 3400a | Microstar Laboratories | N/A | Este é um sistema completo de aquisição de dados com conversor A/D. |
Referências
- Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. Control of traveling waves in the Mammalian cortex. Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).
- Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity....
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Reimpressões e permissões
