שיטות לאפיון Co-הפיתוח של Biofilm ובית גידול הטרוגניות
Summary
Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.
Abstract
Biofilms קהילות חיידקים מצורף משטח שיש לי מבנים מורכבים ולייצר heterogeneities מרחבי משמעותי. פיתוח biofilm מוסדר בחום על ידי הזרימה סביב והסביבה תזונתית. צמיחת biofilm גם מגדילה את ההטרוגניות של מייקרו-הסביבה המקומית על ידי יצירת שדות זרימה מורכבות ודפוסי תחבורה מומסת. כדי לחקור את הפיתוח של ההטרוגניות בbiofilms ואינטראקציות בין biofilms ומיקרו-בית הגידול המקומי שלהם, שגדלנו biofilms מונו-מינים של Pseudomonas aeruginosa וbiofilms כפולים מינים של P. coli aeruginosa וEscherichia תחת הדרגתיים תזונתי בתא זרימת microfluidic. אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים ליצירת שיפועים מזינים בתוך תא הזרימה ולגידול והדמית פיתוח biofilm בתנאים אלה. אנחנו גם פרוטוקולים הנוכחיים לסדרה של שיטות אופטיות לכמת תבניות המרחביות במבנה biofilm, לזרום distributions על biofilms, ותחבורה המונית סביב ובתוך מושבות biofilm. שיטות אלו תומכות חקירות מקיפות של הפיתוח המשותף של ההטרוגניות biofilm ובית גידול.
Introduction
מיקרואורגניזמים לצרף למשטחים וbiofilms טופס – אגרגטים תא סגורים במטריצה תאית-פולימר 1. Biofilms להתנהג בצורה שונה מאוד מתאי חיידקים בודדים, כי יש לי biofilms ההטרוגניות המרחבית דרמטית כתוצאה משילוב של מגבלות תחבורה מומסת הפנימיות ווריאציות מרחבית בחילוף חומרים תאיים 2,3. ריכוזי חמצן וחומרים מזינים להקטין באופן דרסטי בממשק שבין biofilm והסביבה נוזל ומתמעט נוסף בתוך בbiofilm 2. וריאציות מרחבית בנשימת biofilm וסינתזה של חלבון יכולות להתרחש גם כתגובה לחמצן מקומי וזמינות חומרי מזון 2.
בסביבות מימית ואדמה, רוב החיידקים שוכנים בbiofilms. biofilms הטבעי לבצע תהליכים חשובים biogeochemical כולל רכיבה על אופניים פחמן וחנקן והפחתת מתכות 4,5. מבחינה קלינית, היווצרות biofilm היא responsידיהם לריאות ממושכות וזיהומים בדרכי שתן 6. הזיהומים הקשורים biofilm הם בעייתיים מאוד, כי יש לי תאים בbiofilms גבוהה מאוד התנגדות לאנטיביוטיקה בהשוואה לעמיתיהם הפלנקטון 6. בגלל biofilms חשוב בהגדרות שונות, כמות משמעותית של מחקר התמקדה בהבנת הגורמים הסביבתיים השולטים פעילויות biofilm וההטרוגניות המרחבית בbiofilms ומייקרו-הסביבה שמסביב.
מחקרים קודמים מצאו כי פיתוח biofilm מוסדר מאוד על ידי מספר הגורמים סביבתיים: biofilms לפתח מורפולוגיות שונות תחת תנאי זרימה שונים; חמצן וbiofilm השפעת זמינות חומרי מזון מורפולוגיה; ומאמץ גזירה הידרודינמית משפיע על הקובץ המצורף של תאי פלנקטון למשטחים והניתוק של תאים מbiofilms 7-9. יתר על כן, זרימת מצב חיצוני משפיע על המשלוח של int מצעיםo ובתוך biofilms 10. הצמיחה של biofilms גם משנה מקיפה תנאים פיזיים וכימיים. לדוגמא, צמיחת biofilm מובילה לדלדול המקומי של חמצן וחומרים מזינים 2; biofilms לצבור תרכובות אורגניות ואורגניות מהסביבה 11; ואשכולות biofilm להסיט חיכוך זרימה ומשטח עליית 12,13. בגלל biofilms אינטראקציה עם סביבתם סביבה בדרכים מורכבות מאוד, זה קריטי כדי להשיג מידע על מאפייני biofilm ותנאים סביבתיים בו-זמנית, וגישות רב-תחומיות צריכים לשמש כדי לאפיין באופן מקיף אינטראקציות biofilm-סביבה.
כאן אנו מציגים סדרה של שיטות משולבות לאפיון דפוסים מרחביים בהתפתחותם של חיידקים בתוך מונו-מינים וbiofilms כפולים מינים תחת שיפוע תזונתי שהוטל, ולצפות בשינוי של כימי המקומית ומייקרו-סביבת נוזל וכתוצאה מכך. אנו אשוחרח 'מתאר את השימוש של זרימת microfluidic תא כניסה כפולה לפותח לאחרונה להתבונן צמיחת biofilm תחת מילויים כימיים מוגדרים היטב. לאחר מכן, אנו מדגימים את השימוש בתא זרימת microfluidic זה להתבונן הצמיחה של שני מינים של חיידקים, Pseudomonas aeruginosa וEscherichia coli, בbiofilms תחת מגוון של תנאים תזונתיים. אנו מראים כיצד בהדמיה באתרו של התפשטות נותב ניאון למושבות biofilm ניתן להשתמש כדי להעריך כמותית דפוסי התחבורה מומסת בbiofilms. לבסוף, אנו מראים כיצד velocimetry מעקב חלקיקים המיקרוסקופי, שבוצע תחת מיקרוסקופ confocal, יכול לשמש כדי לקבל שדה זרימה מקומי סביב biofilms גדל.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנחנו הוכיחו חבילה של שיטות כדי לאפיין שלוש אינטראקציות biofilm-סביבה חשובות: תגובת biofilm הדרגתי כימי, השפעות של צמיחת biofilm על זרימת מייקרו-הסביבה שמסביב, וההטרוגניות biofilm כתוצאה ממגבלות תחבורה פנימיות.
אנחנו הראיתי לראשונה את השימוש …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למאט Parsek באוניברסיטת וושינגטון (סיאטל, וושינגטון) למתן פ aeruginosa וא זני coli ורוג'ר נוקס באוניברסיטת קנטרברי (ניו זילנד) למתן גישה לתוכנת זרמים. עבודה זו נתמכה על ידי R01AI081983 מענק מהמכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. ההדמיה confocal בוצעה במתקן נורת 'ווסטרן הביולוגי ההדמיה (BIF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 mL TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters- sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
Referências
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
