Métodos de caracterização da Co-desenvolvimento de biofilme e Habitat Heterogeneidade

Summary

Os biofilmes têm interações complexas com o ambiente circundante. Para investigar de forma abrangente as interações biofilme-ambiente, apresentamos aqui uma série de métodos para criar um ambiente químico heterogêneo para o desenvolvimento do biofilme, quantificar a velocidade do fluxo local e analisar o transporte de massa dentro e ao redor das colônias de biofilme.

Abstract

Os biofilmes são comunidades microbianas em anexo de superfície que têm estruturas complexas e produzem heterogeneidades espaciais significativos. O desenvolvimento do biofilme é fortemente regulada pelo fluxo envolvente e ambiente nutricional. O crescimento do biofilme também aumenta a heterogeneidade do microambiente local, gerando campos de fluxo e os padrões complexos de transporte de solutos. Para investigar o desenvolvimento da heterogeneidade em biofilmes e interações entre biofilmes e sua micro-habitat local, nós crescemos biofilmes mono-espécies de Pseudomonas aeruginosa e biofilmes dual-espécies de P. aeruginosa e Escherichia Coli sob gradientes nutricionais em uma célula de fluxo de microfluidos. Nós proporcionam protocolos detalhados para a criação de gradientes de nutrientes dentro da célula de fluxo e para o crescimento e desenvolvimento de biofilme visualização sob estas condições. Nós também protocolos atuais para uma série de métodos ópticos para quantificar padrões espaciais na estrutura do biofilme, o fluxo distribuições sobre biofilmes, e transporte de massa ao redor e dentro de colônias de biofilme. Estes métodos apoiar investigações abrangentes do co-desenvolvimento de biofilme e habitat heterogeneidade.

Introduction

Microorganismos se prendem às superfícies e biofilmes de formulário - agregados de células fechadas em uma matriz extracelular-polímero ^1. Os biofilmes se comportam de forma muito diferente a partir de células microbianas individuais, pois biofilmes tem heterogeneidade espacial dramática resultante de uma combinação de limitações de transporte de soluto internos e variações espaciais no metabolismo celular ^2,3. As concentrações de oxigênio e de nutrientes diminuem drasticamente na interface entre biofilme e em torno de fluido e se ainda mais empobrecido dentro no biofilme ^2. As variações espaciais na respiração do biofilme e a síntese....

Protocol

1. Fluxo Setup celular e Inoculação

NOTA:. Use uma célula de fluxo microfluídicos dupla via de entrada descrito no Song et al, 2014 ¹⁴ para crescer biofilmes. Esta célula de fluxo é capaz de criar gradientes químicos suaves bem definidos. O desenho da célula de fluxo é mostrado na Figura 1 e o fluxo de fabricação de células foi previamente descrito em Song et al., 2014 ^14. Aqui detalhes nossos métodos usando P. aeruginosa e E. coli para formar biofilmes, mas outras espécies podem também ser adequados. Usamos P. aeruginosa PAO1- GFP, que con....

Results

A célula de fluxo microfluidico dupla via de entrada permite a observação do crescimento do biofilme sob um gradiente de química bem definida formada pela mistura de duas soluções no interior da câmara de fluxo. O gradiente químico resultante foi anteriormente observado por injeção de corante e caracterizados em detalhe por Song et al. ^14. Gradientes de concentração lisas foram formados na direcção transversal, tal como mostrado na Figura 1. O perfil de concentração foi íngreme perto.......

Discussion

Nós demonstramos um conjunto de métodos para caracterizar três importantes interações biofilme-ambientais: resposta biofilme para gradientes químicos, efeitos do crescimento do biofilme sobre o microambiente fluxo envolvente, e heterogeneidade biofilme resultante de limitações de transporte interno.

Nós mostramos pela primeira vez o uso de uma nova célula de fluxo de microfluidos para impor um gradiente de química bem definida para o desenvolvimento do biofilme. Para criar um gradiente de qu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bomba Peristáltica	Gilson	Miniplus 3	Configuração e inoculação de células de fluxo
Tubulação da bomba 0.50  mm OVC, Laranja/Amarelo		Gilson F117934	Configuração e inoculação de células
de fluxo Torneira de três vias com Giratório Macho Luer lock	Smiths Medical	Configuração	e inoculação de células de fluxo
Encapsulamento de células solares Sylgard 184 para fazer painéis solares	ML Solar LLC		Configuração e inoculação de células de fluxo
Garrafa média Pyrex, 1  L, GL45	VWR	16157-191	Configuração e inoculação da célula de fluxo
Tubulação C-FLEX	Cole-Parmer	06422-02	Configuração e inoculação da célula de fluxo 1
ml TB Seringa	BD	309659	Configuração e inoculação da célula de fluxo
Tubulação de polímero	IDEX	1520G	Configuração e inoculação da célula de fluxo
Adaptador de Stub Luer Intramédico Estéril	Clay Adams	427564	Configuração e inoculação de células de fluxo
Agulha PrecisionGlide	BD	305195	Configuração e inoculação de células de fluxo
Espectrofotômetro	HACH		Configuração e inoculação de células de fluxo
Filtros de seringa - estéreis (0,2 μ m)	Fisherbrand	09-719A Configuração e	inoculação da célula de fluxo
MAXQ Shaker	Thermo Scientific		Configuração e inoculação da célula de fluxo
Sulfato de amônio	Sigma Aldrich	A4418	Meio de crescimento
Fosfato de sódio dibásico anidro	Sigma Aldrich	RES20908-A7	Meio de crescimento
Fosfato de potássio monobásico	Sigma Aldrich	P5655	Meio de crescimento
Cloreto de sódio	Sigma Aldrich	S7653	Meio de crescimento
Cloreto de magnisium	Sigma Aldrich	M8266	Meio de crescimento
Cloreto de cálcio	Sigma Aldrich	C5670	Meio de crescimento
Sulfato de cálcio di-hidratado	Sigma Aldrich	C3771	Meio de crescimento
Sulfato de ferro (II) heptahidratado	Sigma Aldrich	215422	Meio de crescimento
Sulfato de manganês (II) monohidratado	Sigma Aldrich	M7634	Meio de crescimento
Sulfato de cobre (II)	Sigma Aldrich	451657	Meio de crescimento
Sulfato de zinco heptahidratado	Sigma Aldrich	Z0251	Meio de crescimento
Sulfato de cobalto (II) heptahidratado	Sigma Aldrich	C6768	Meio de crescimento
Molibdato de sódio	Sigma Aldrich	243655	Meio de crescimento
Ácido bórico	Sigma Aldrich	B6768	Meio de crescimento
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	Meio de crescimento
Luria Bertani Caldo	Sigma Aldrich	L3022	Meio de crescimento
TCS SP2 Microscopia Confocal	Leica		Imagem fluorescente
SYTO 62	Life Technology	S11344	Imagem fluorescente
Cy5	GE Healthcare Life Sciences	PA15100	Imagem fluorescente
Fluorescente vermelha (580/605) FluoSphere	Life Technology	F-8801	Imagem fluorescente
BioSPA	Packman Lab		Processamento de imagem
ImageJ	NIH		Processamento de imagem
Volocidade	PerkinElmer		Image Processing
Streams 2.02	Processamento de imagens da Universidade de Cantebury