Metoder for å karakterisere Co-utvikling av Biofilm og Habitat Heterogenitet
Summary
Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.
Abstract
Biofilmer er overflate festet mikrobielle samfunn som har komplekse strukturer og produserer betydelige romlige heterogeniteter. Biofilm utvikling er sterkt regulert av den omgivende strømmen og næringsmiljø. Biofilmvekst øker også heterogenitet i den lokale mikromiljøet ved å generere komplekse strømningsfelt og oppløst stoff transportmønstre. For å undersøke utviklingen av heterogenitet i biofilmer og interaksjoner mellom biofilmer og deres lokale mikro-habitat, vokste vi mono-arter biofilm av Pseudomonas aeruginosa og dual-arter biofilm av P. aeruginosa og Escherichia coli i henhold til ernæringsmessige gradienter i et mikrofluidstrømningscellen. Vi gir detaljerte protokoller for å skape nærings gradienter innen strømningscellen og for dyrking og visualisere biofilm utvikling under disse forholdene. Vi presenterer også protokoller for en serie av optiske metoder for å kvantifisere romlige mønstre i biofilm struktur, flyte distributions løpet biofilm, og massetransport rundt og innenfor biofilm kolonier. Disse metodene støtter omfattende undersøkelser av co-utvikling av biofilm og habitat heterogenitet.
Introduction
Mikroorganismer feste til overflater og danner biofilm – cellleaggregater vedlagt i et ekstracellulært-polymer matrise 1. Biofilmer oppføre seg svært forskjellig fra individuelle mikrobielle celler, fordi biofilmer har dramatiske romlig heterogenitet som skyldes en kombinasjon av oppløst stoff interne transportbegrensninger og romlige variasjoner i cellulær metabolisme 2,3. Oksygen og næringsstoffer konsentrasjoner drastisk nedgang i grenseflaten mellom biofilm og omkringliggende væske og få ytterligere utarmet innenfor i biofilm to. Romlige variasjoner i biofilm respirasjon og proteinsyntese kan også oppstå som en respons på lokaliserte oksygen og næringsstoffer 2.
I akvatiske og jord miljøer, de fleste bakterier bor i biofilm. Naturlige biofilmer utføre viktige biogeokjemiske prosesser, inkludert sykling karbon og nitrogen og redusere metaller 4,5. Klinisk er biofilmdannelse responsusynlige for langvarig lunge og urinveisinfeksjoner 6. Biofilmassosierte infeksjoner er svært problematisk fordi cellene i biofilmer har ekstremt høy motstand mot antimikrobielle midler i forhold til sine planktoniske kolleger 6. Fordi biofilm er viktige i ulike innstillinger, har en betydelig mengde forskning vært fokusert på å forstå de miljømessige faktorene som styrer biofilm aktiviteter og romlig heterogenitet i biofilmer og det omkringliggende mikromiljøet.
Tidligere studier har funnet at biofilm utvikling er sterkt regulert av en rekke miljøfaktorer: biofilmer utvikle ulike morfologi under ulike strømningsforhold; oksygen og næringsstoffer innflytelse biofilm morfologi, og hydrodynamiske skjærspenning påvirker bindingen av planktoniske celler til overflater og løsgjøring av celler fra biofilmer 7-9. Videre påvirker flyten tilstand ekstern levering av underlag into og innen biofilm 10. Vekst av biofilm endrer også omkringliggende fysiske og kjemiske forhold. For eksempel fører biofilmveksten av lokal utarming av oksygen og næringsstoffer 2; biofilmer akkumulere uorganiske og organiske forbindelser fra omgivelsene 11; og biofilm klynger avlede strømmen og øker overflatefriksjonen 12,13. Fordi biofilmer samhandle med deres omkringliggende miljø i svært komplekse måter, er det viktig å samtidig få informasjon om biofilm egenskaper og miljømessige forhold, og flerfaglige tilnærminger må brukes til omfattende karakter biofilm-miljø interaksjoner.
Her presenterer vi en serie av integrerte metoder for å karakterisere romlige mønstre i mikrobiell vekst innen mono-arter og dual-arter biofilm under en pålagt ernæringsmessig gradient, og å observere den resulterende endring av lokal kjemisk og væske mikromiljøet. Vi first beskriver anvendelse av et nylig utviklet doble innløpsmikrofluidstrømningscellen for å observere biofilm vekst under veldefinerte kjemiske gradienter. Vi demonstrerer bruken av denne mikrofluidstrømningscellen for å observere vekst av to arter av bakterier, Pseudomonas aeruginosa og Escherichia coli, i biofilmer under en rekke næringsforhold. Vi viser hvordan in situ visualisering av fluoriserende spor forplantning inn i biofilm kolonier kan brukes til å kvantitativt vurdere mønstre av oppløst stoff transport i biofilmer. Endelig viser vi hvordan mikropartikkelsporings velocimetry, utført under konfokal mikroskopi, kan anvendes for å oppnå lokal strømningsfeltet rundt de voksende biofilmer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi viste en pakke med metoder for å karakterisere tre viktige biofilm-miljø interaksjoner: biofilm respons på kjemiske gradienter, effekter av biofilm vekst på rundt flyt mikromiljøet, og biofilm heterogenitet som følge av interne transport begrensninger.
Vi først viste bruk av en roman mikrofluidstrømning celle å ilegge en veldefinert kjemisk gradient for biofilm utvikling. For å generere en veldefinert kjemisk gradient i strømningscellen, er det viktig å opprettholde den samme …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Matt PARSEK ved University of Washington (Seattle, Washington) for å gi P. aeruginosa og E. coli-stammer og Roger Nokes ved Universitetet i Canterbury (New Zealand) for å gi tilgang til Streams programvare. Dette arbeidet ble støttet av tilskuddet R01AI081983 fra National Institutes of Health, National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer. Konfokal bildebehandling ble utført ved Northwestern Biological Imaging Facility (BIF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 mL TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters- sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
Referências
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
