Métodos de caracterização da Co-desenvolvimento de biofilme e Habitat Heterogeneidade
Summary
Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.
Abstract
Os biofilmes são comunidades microbianas em anexo de superfície que têm estruturas complexas e produzem heterogeneidades espaciais significativos. O desenvolvimento do biofilme é fortemente regulada pelo fluxo envolvente e ambiente nutricional. O crescimento do biofilme também aumenta a heterogeneidade do microambiente local, gerando campos de fluxo e os padrões complexos de transporte de solutos. Para investigar o desenvolvimento da heterogeneidade em biofilmes e interações entre biofilmes e sua micro-habitat local, nós crescemos biofilmes mono-espécies de Pseudomonas aeruginosa e biofilmes dual-espécies de P. aeruginosa e Escherichia Coli sob gradientes nutricionais em uma célula de fluxo de microfluidos. Nós proporcionam protocolos detalhados para a criação de gradientes de nutrientes dentro da célula de fluxo e para o crescimento e desenvolvimento de biofilme visualização sob estas condições. Nós também protocolos atuais para uma série de métodos ópticos para quantificar padrões espaciais na estrutura do biofilme, o fluxo distribuições sobre biofilmes, e transporte de massa ao redor e dentro de colônias de biofilme. Estes métodos apoiar investigações abrangentes do co-desenvolvimento de biofilme e habitat heterogeneidade.
Introduction
Microorganismos se prendem às superfícies e biofilmes de formulário – agregados de células fechadas em uma matriz extracelular-polímero 1. Os biofilmes se comportam de forma muito diferente a partir de células microbianas individuais, pois biofilmes tem heterogeneidade espacial dramática resultante de uma combinação de limitações de transporte de soluto internos e variações espaciais no metabolismo celular 2,3. As concentrações de oxigênio e de nutrientes diminuem drasticamente na interface entre biofilme e em torno de fluido e se ainda mais empobrecido dentro no biofilme 2. As variações espaciais na respiração do biofilme e a síntese de proteínas também podem ocorrer como uma resposta ao oxigénio localizada a disponibilidade de nutrientes e 2.
Em ambientes aquáticos e do solo, a maioria das bactérias habitam em biofilmes. Biofilmes naturais realizar processos biogeoquímicos importantes, incluindo o ciclo do carbono e nitrogênio e reduzindo metais 4,5. Clinicamente, a formação de biofilme é responsvel para pulmonar prolongada e infecções urinárias 6. Infecções associadas ao biofilme são altamente problemático porque as células em biofilmes tem altíssima resistência aos antimicrobianos em comparação com os seus homólogos planctônicas 6. Porque biofilmes são importantes em diversos contextos, uma quantidade substancial de investigação tem-se centrado na compreensão dos fatores ambientais que controlam as atividades de biofilme e da heterogeneidade espacial em biofilmes e do microambiente circundante.
Estudos anteriores mostraram que o desenvolvimento do biofilme é fortemente regulado por uma série de factores ambientais: biofilmes desenvolver diferentes morfologias sob várias condições de fluxo; oxigênio e nutrientes disponibilidade influência morfologia biofilme; e tensões hidrodinâmicas afeta a fixação de células planctônicas a superfícies e o desprendimento de células de biofilmes 7-9. Além disso, a condição de escoamento externo influencia a entrega de substratos into e dentro de biofilmes 10. O crescimento de biofilmes também altera circundante condições físicas e químicas. Por exemplo, o crescimento de biofilme conduz à depleção local do oxigénio e nutrientes 2; biofilmes acumular compostos inorgânicos e orgânicos provenientes do ambiente circundante 11; e agrupamentos de biofilme desviar incremento da superfície de fricção do fluxo e 12,13. Porque biofilmes interagir com o seu ambiente circundante em formas muito complexas, é crítico para a obtenção simultânea das informações sobre as propriedades de biofilme e condições ambientais, e multidisciplinares precisam de ser usados para caracterizar exaustivamente interacções-biofilme ambiente.
Aqui apresentamos uma série de métodos integrados para caracterizar padrões espaciais em crescimento microbiano dentro mono-espécies e biofilmes dual-espécies sob um gradiente nutricional imposta, bem como observar a modificação resultante do produto químico local e microambiente fluido. Nós firr descrevem a utilização de uma célula de dupla via de entrada de fluxo de microfluidos recentemente desenvolvido para observar o crescimento do biofilme sob gradientes químicos bem definidos. Em seguida, demonstrar a utilização dessa célula de fluxo de microfluidos para observar o crescimento de duas espécies de bactérias Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e, em biofilmes sob uma gama de condições nutricionais. Mostramos como na visualização situ de propagação marcador fluorescente em colônias biofilme pode ser usado para avaliar quantitativamente os padrões de transporte de soluto em biofilmes. Finalmente, mostra-se como microescala velocimetria de rastreamento de partículas, realizada sob microscopia confocal, pode ser usado para obter o fluxo de campo local em torno dos biofilmes em crescimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós demonstramos um conjunto de métodos para caracterizar três importantes interações biofilme-ambientais: resposta biofilme para gradientes químicos, efeitos do crescimento do biofilme sobre o microambiente fluxo envolvente, e heterogeneidade biofilme resultante de limitações de transporte interno.
Nós mostramos pela primeira vez o uso de uma nova célula de fluxo de microfluidos para impor um gradiente de química bem definida para o desenvolvimento do biofilme. Para criar um grad…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Matt Parsek na Universidade de Washington (Seattle, WA) para a prestação de P. aeruginosa e E. coli e Roger Nokes da Universidade de Canterbury (Nova Zelândia) para fornecimento de acesso a software córregos. Este trabalho foi financiado pela concessão R01AI081983 dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas. Imagem confocal foi realizada no Facility Northwestern Imagem Biológica (BIF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 mL TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters- sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
Referências
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
