Los métodos para la caracterización de la Co-desarrollo de la biopelícula y Hábitat Heterogeneidad
Summary
Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.
Abstract
Los biofilms son comunidades microbianas unido a la superficie que tienen estructuras complejas y producen heterogeneidades espaciales significativos. El desarrollo del biofilm está fuertemente regulada por el flujo que rodea y el entorno nutricional. El crecimiento de biopelículas también aumenta la heterogeneidad de la microambiente local mediante la generación de campos de flujo complejos y patrones de transporte de solutos. Para investigar el desarrollo de la heterogeneidad en los biofilms y las interacciones entre los biofilms y su micro-hábitat local, crecimos biofilms mono-especies de Pseudomonas aeruginosa y biofilms de doble especies de P. aeruginosa y Escherichia coli bajo gradientes nutricionales en una celda de flujo de microfluidos. Proporcionamos protocolos detallados para la creación de gradientes de nutrientes dentro de la célula de flujo y para el cultivo y visualizar el desarrollo de biopelículas en estas condiciones. También protocolos actuales para una serie de métodos ópticos para cuantificar patrones espaciales en la estructura de la biopelícula, distri fluirbuciones sobre las biopelículas, y el transporte de masa alrededor y dentro de colonias de biopelícula. Estos métodos son compatibles con una amplia investigación sobre el co-desarrollo de biopelículas y la heterogeneidad de hábitats.
Introduction
Los microorganismos se adhieren a las superficies y formar biopelículas – agregados de células encerradas en una matriz extracelular-polímero 1. Las biopelículas se comportan de manera muy diferente a partir de células microbianas individuales, porque biofilms tienen heterogeneidad espacial dramática resultante de una combinación de limitaciones de transporte de solutos internos y las variaciones espaciales en el metabolismo celular 2,3. Las concentraciones de oxígeno y de nutrientes disminuyen drásticamente en la interfaz entre biofilm y fluido circundante y se agotan más dentro en la biopelícula 2. Las variaciones espaciales en la respiración de biopelículas y la síntesis de proteínas también pueden ocurrir como respuesta al oxígeno localizada y la disponibilidad de nutrientes 2.
En los ambientes acuáticos y del suelo, la mayoría de las bacterias viven en los biofilms. Biofilms naturales llevan a cabo importantes procesos biogeoquímicos incluyendo el ciclo del carbono y nitrógeno y reduciendo metales 4,5. Clínicamente, la formación de biopelículas es responsble para pulmonar prolongada e infecciones urinarias 6. Infecciones biofilm asociado son muy problemático porque las células en biofilms tienen muy alta resistencia a los antimicrobianos en comparación con sus homólogos planctónicas 6. Debido a que las biopelículas son importantes en diversos entornos, una cantidad sustancial de investigación se ha centrado en la comprensión de los factores ambientales que controlan las actividades de biofilm y la heterogeneidad espacial en biofilms y el microambiente que rodea.
Estudios previos han encontrado que el desarrollo de biopelículas está fuertemente regulada por una serie de factores ambientales: biopelículas se desarrollan diferentes morfologías en diversas condiciones de flujo; oxígeno y nutrientes disponibilidad influencia morfología de la biopelícula; y la tensión de cizallamiento hidrodinámico afecta a la unión de las células planctónicas a las superficies y el desprendimiento de las células de las biopelículas 7-9. Por otra parte, el estado de flujo externo influye en la entrega de los sustratos into y dentro de los biofilms 10. El crecimiento de biofilms también altera rodea condiciones físicas y químicas. Por ejemplo, el crecimiento de biopelículas conduce a la reducción local de oxígeno y nutrientes 2; biofilms se acumulan compuestos inorgánicos y orgánicos desde el ambiente circundante 11; y grupos de biofilm desvían el flujo y el aumento de superficie de fricción 12,13. Debido a que las biopelículas interactúan con su entorno de maneras muy complejas, es fundamental para obtener simultáneamente información sobre las propiedades del biofilm y las condiciones ambientales, y los enfoques multidisciplinarios necesita ser utilizado para caracterizar exhaustivamente interacciones biofilm y medio ambiente.
Aquí les presentamos una serie de métodos integrados para caracterizar los patrones espaciales en el crecimiento microbiano en mono-especies y biofilms de doble especies bajo un gradiente nutricional impuesta, y observar la consiguiente modificación de la química local y microambiente fluido. Nos FIRst describen el uso de una celda de flujo microfluídico de doble entrada recientemente desarrollado para observar el crecimiento de biopelícula bajo gradientes químicos bien definidos. A continuación, demuestran el uso de esta celda de flujo de microfluidos para observar el crecimiento de dos especies de bacterias, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli, en biofilms bajo un rango de condiciones nutricionales. Se muestra cómo pt la visualización in situ de propagación trazador fluorescente en colonias de biopelícula puede ser utilizado para evaluar cuantitativamente los patrones de transporte de solutos en biofilms. Por último, se muestra cómo microescala velocimetría de seguimiento de partículas, realizado con microscopía confocal, se puede utilizar para obtener el campo de flujo local alrededor de las biopelículas que crecen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos demostrado una serie de métodos para caracterizar tres importantes interacciones biofilm-ambiente: respuesta biofilm a gradientes químicos, los efectos de la formación de biopelículas en el microambiente que rodea el flujo, y la heterogeneidad biofilm resultante de las limitaciones de transporte interno.
En primer lugar, demostramos el uso de una celda de flujo de microfluidos novedoso para imponer un gradiente químico bien definido para el desarrollo de biopelículas. Para genera…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Matt Parsek en la Universidad de Washington (Seattle, WA) para proporcionar P. aeruginosa y E. cepas de E. coli y Roger Nokes de la Universidad de Canterbury (Nueva Zelanda) para proporcionar acceso a software Arroyos. Este trabajo fue apoyado por el subsidio R01AI081983 de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas. Confocal de imágenes se realizó en las instalaciones de la Northwestern Imaging Biológica (BIF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 mL TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters- sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
Referências
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