CXCR6.Gfp रिपोर्टर चूहों का उपयोग स्वस्थ और रोगग्रस्त जिगर में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लॉन्ग टर्म intravital Multiphoton माइक्रोस्कोपी इमेजिंग
Summary
Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.
Abstract
चोट करने के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में जिगर में सूजन monocytes, न्यूट्रोफिल, टी सेल सबसेट, बी कोशिकाओं, प्राकृतिक हत्यारा (एन.के.) और NKT कोशिकाओं सहित leukocytes के विशिष्ट उपप्रकार की घुसपैठ से जुड़े एक बेहद गतिशील प्रक्रिया है। प्रतिरक्षा सेल प्रवास की निगरानी के लिए जिगर के intravital माइक्रोस्कोपी के कारण नमूना तैयार करने और निर्धारण, ऑप्टिकल संकल्प और लंबी अवधि के पशु अस्तित्व के बारे में उच्च आवश्यकताओं के लिए विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है। फिर भी, सूजन प्रक्रियाओं के साथ-साथ सेलुलर बातचीत के अध्ययन की गतिशीलता बेहतर भड़काऊ जिगर की बीमारी की दीक्षा, प्रगति और प्रतिगमन को समझने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सके। इसलिए, एक बेहद संवेदनशील और विश्वसनीय विधि गहन देखभाल के साथ संयोजन में प्रवास और intravital दो photon लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (TPLSM) से लंबी अवधि (लगभग 6 घंटा) पर माउस जिगर में अलग प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सेल सेल-बातचीत का अध्ययन करने के लिए स्थापित किया गया था निगरानी।
ईएनटी "> प्रदान की विधि एक सज्जन तैयारी और अंग की न्यूनतम गड़बड़ी के साथ जिगर के स्थिर निर्धारण भी शामिल है, लंबी अवधि के intravital इमेजिंग ट्रैकिंग की अनुमति देता है, अप करने के लिए 6 घंटा की एक समय अवधि में वास्तव में कोई photobleaching या phototoxic प्रभाव के साथ बहुरंगा multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग और माउस के महत्वपूर्ण मापदंडों और परिसंचरण, तापमान और गैस विनिमय के स्थिरीकरण की व्यापक निगरानी की वजह से स्थिर इमेजिंग की स्थिति, विशिष्ट ल्युकोसैट कैंपेन्स की।CXCR6.gfp जिगर में सूजन पर लिम्फोसाइट प्रवास जांच करने के लिए दस्तक में चूहों आधारभूत शर्तों के तहत और कार्बन टेट्राक्लोराइड का intraperitoneal इंजेक्शन (एस) (सीसीएल 4) द्वारा प्रेरित तीव्र और जीर्ण जिगर की क्षति के बाद intravital जिगर इमेजिंग के अधीन थे।
प्राकृतिक हत्यारा (एन.के.) – – इसके अलावा और ऐसी सीडी 4 टी कोशिकाओं के रूप में टी lymphocytes के सबसेट लेकिन श्लैष्मिक एसोसिएशन CXCR6 मुख्य रूप से प्राकृतिक हत्यारा टी (NKT) पर लिम्फोसाइटों पर व्यक्त एक केमोकाइन रिसेप्टर है,पैदा अपरिवर्तनीय (MAIT) टी कोशिकाओं 1। एक जिगर चोट पर उनकी बदल व्यवहार में विस्तृत जानकारी और रोग प्रगति में इसलिए उनके संभावित भागीदारी की अनुमति दी CXCR6.gfp + प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवासी पैटर्न और स्थिति के बाद।
Introduction
कोशिकाओं और पूरे अंगों में सेलुलर कार्यों या यहां तक कि पूरे जीवों के दृश्य के शरीर दो के लगभग सभी भागों सहित 50 से अधिक वर्षों के लिए महान ब्याज की गई है। इसलिए, कुछ प्रारंभिक अध्ययन पहले से ही जिगर 3,4 के intravital इमेजिंग कार्यरत हैं। हालांकि, कई सीमाएं जिगर ऊतक के लंबे समय तक स्थिर उच्च संकल्प इमेजिंग के बारे में तारीख करने के लिए मौजूद हैं।
कारण डायाफ्राम और जठरांत्र संबंधी मार्ग 5 के साथ निकट संपर्क में जिगर की शारीरिक स्थिति के लिए, सूक्ष्म intravital इमेजिंग के लिए सबसे आम समस्या आंत्र पथ 6 की एक हद तक कम करने, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला, आंदोलन श्वसन की वजह से है और। अन्य ठोस अंगों की तुलना में, जिगर सर्जरी विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है। कारण घने माइक्रोवैस्कुलर संरचना करने के लिए, शल्य चिकित्सा में गड़बड़ी, भारी रक्तस्रावी घावों के निवासी का बिगड़ा microcirculation में सात और भी सक्रियण नेतृत्व कर सकते हैं मैंऐसे Kupffer कोशिकाओं के रूप में 8 mmune कोशिकाओं। इसलिए, ऊतक के यांत्रिक निर्धारण 6,9 intravital माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप करने की संभावना है कहीं और प्रकाशित के रूप में।
एक स्वस्थ जिगर में, कुल रक्त की मात्रा का 10-15% जिगर vasculature के भीतर रहता है, और अंग संचलन में परिवर्तन (जैसे, रक्तचाप में उतार-चढ़ाव के लिए अत्यधिक अतिसंवेदनशील अंग प्रतिपादन, समग्र कार्डियक आउटपुट 10 में से लगभग 25% प्राप्त करता है )। इसलिए, अत्यधिक होने के कारण ऊतक से निपटने या केंद्रीकृत परिसंचरण द्वारा जैसे, कतरनी तनाव, विस्थापन, चोट करने के लिए यकृत रक्त प्रवाह में बाधा के रूप में अच्छी तरह से जिगर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित करने, ल्युकोसैट प्रवासी व्यवहार में कृत्रिम परिवर्तन, बिगड़ा जिगर oxygenation और इसलिए आगे जिगर की क्षति के लिए नेतृत्व करेंगे अंग संरक्षण और जानवर के समग्र जीवन समय के रूप में।
प्रारंभिक सूक्ष्म पढ़ाई intravital epifluorescence मील पर आधारित थेcroscopy, लेकिन इस तरह के फोटो विरंजन और कम प्रवेश गहराई के रूप में कई तकनीकी बाधाओं दीर्घकालिक जिगर इमेजिंग 4,11,12 के लिए इस तकनीक के उपयोग की सीमा। इस नई विधि वास्तविक जीवन स्थितियों 13-15 के तहत लगभग सभी अंगों में इमेजिंग अध्ययन प्रदर्शन करने के लिए तकनीकी रूप से सक्षम था के रूप में 1990 के दशक में multiphoton माइक्रोस्कोपी के विकास के साथ, फोटो विरंजन या प्रवेश गहराई की सीमाओं को मुख्य रूप से हल कर रहे थे। हालांकि, जिगर इमेजिंग के संबंध में मुख्य शेष चुनौतियों थे: कई घंटा 16 वर्ष की लंबी अवधि के लिए यकृत sinusoids में अनछुए रक्त का प्रवाह है, और विशेष रूप से स्थिर इमेजिंग हासिल सांस आंदोलनों, जिगर ऊतक के autofluorescence,।
कई अध्ययनों से जिगर में 17, उदाहरण के लिए, NKT कोशिकाओं 18-20, टी कोशिकाओं 21,22, जिगर मैक्रोफेज 23,24 या न्यूट्रोफिल 25, दीर्घकालिक multiphoton एम समारोह और विभिन्न leukocytes के प्रवास को संबोधित यद्यपिicroscopy इमेजिंग अभी तक सफलतापूर्वक कारण आगे के नुकसान से 26 मौजूदा क्षति है और इसलिए उच्च संवेदनशीलता के लिए एक कार्य और भी चुनौतीपूर्ण तीव्र या जीर्ण जिगर की बीमारी के साथ जानवरों में, स्थापित नहीं किया गया था। हालांकि, वास्तविक समय में जिगर में leukocytes के प्रवासी व्यवहार और सेलुलर समारोह की निगरानी जिगर homeostasis और रोग 27 में उनकी विशेष भूमिका में उपन्यास अंतर्दृष्टि देता है।
केमोकाइन रिसेप्टर CXCR6 प्राकृतिक हत्यारा (एन.के.) कोशिकाओं, NKT कोशिकाओं और कुछ टी सेल आबादी 18,28 सहित कई लिम्फोसाइट कैंपेन्स, पर व्यक्त की है। चूहों में पूर्व के अध्ययन CXCR6 और उसके आत्मीय ligand के CXCL16 समस्थिति दौरान जिगर sinusoids पर NKT कोशिकाओं की गश्त नियंत्रित कर सकते हैं कि संकेत दिया है। नतीजतन, (CXCR6 लोकस में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन [GFP] की एक दस्तक में ले जाने) CXCR6.gfp चूहों का उपयोग इस तरह के मस्तिष्क के रूप में 29 विभिन्न अंगों में लिम्फोसाइटों के पलायन की जांच के लिए वर्णित किया गया हैऔर भी जिगर 18,20, सूजन पर CXCR6.gfp कोशिकाओं की घुसपैठ में वृद्धि हुई दिखा रहा है।
इस अध्ययन में प्रदान की विधि के साथ यह स्थिर शर्तों के तहत समय की एक लंबी अवधि में इन प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए संभव था। intravital multiphoton आधारित प्रक्रिया पशु और अंग की न्यूनतम गड़बड़ी के साथ अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य था कि इमेजिंग की अनुमति दी; श्वसन और रक्त परिसंचरण के करीब नियंत्रण द्वारा पीछा व्यापक निगरानी से लंबी अवधि के पशु अस्तित्व के लिए अनुकूलित; और अत्यधिक लचीला और आसान जैसे गुर्दे या तिल्ली के रूप में अन्य parenchymal अंगों को भी अपनाने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे अध्ययन का उद्देश्य जिगर की intravital TPLSM इमेजिंग के लिए एक अत्यधिक, मानकीकृत स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि विकसित करने के लिए किया गया था। सामान्य रूप में intravital इमेजिंग घर वापस आना और विकास…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.
Materials
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25mL Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0,5ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
Referências
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