Tumor primário e isolamento de células MEF para o Estudo de metástases pulmonares

Resumo

O objetivo deste protocolo é estudar a tumorigênese mamária. Com esta técnica, os tumores mamários de camundongos são removidos e as células primárias são preparadas a partir dos tumores. Um protocolo de extração pulmonar está incluído para estudar metástases pulmonares. Além disso, outro protocolo para análise de fibroblastos embrionários de camundongo do embrião de camundongo está incluído.

Resumo

Na tumorigênese mamária, o estágio metastático da doença representa a maior ameaça para o indivíduo afetado. Células mamárias normais com genótipos alterados agora possuem a capacidade de invadir e sobreviver em outros tecidos. Neste protocolo, os tumores mamários de camundongos são removidos e as células primárias são preparadas a partir dos tumores. As células isoladas deste procedimento estão então disponíveis para experimentos de perfil genético. Para uma metástase bem-sucedida, essas células devem ser capazes de intravasar, sobreviver em circulação, extravasar para órgãos distantes e sobreviver nesse novo sistema de órgãos. Os pulmões são o alvo típico da metástase do câncer de mama. Foi descoberto um conjunto de genes que medeia a seletividade da metástase para o pulmão. Aqui descrevemos um método de estudo de metástase pulmonar a partir de um modelo de camundongo geneticamente modificado. Além disso, outro protocolo para análise de fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) do embrião de camundongo está incluído. As células MEF do mesmo tipo animal fornecem uma pista da expressão gênica de células não cancerígenas. Juntas, essas técnicas são úteis no estudo da tumorigênese mamária de camundongos, seus mecanismos de sinalização associados e vias das anormalidades em embriões.

Introdução

A metástase é a etapa final na progressão do câncer de mama ¹. Envolve uma série de etapas nas quais as células malignas são liberadas do tumor primário e disseminadas para outros órgãos ². As células devem ser capazes de intravasar, sobreviver em circulação, extravasar para órgãos distantes e sobreviver nesse novo sistema de órgãos ³. Cada etapa da tumorigênese é rigidamente controlada pelas células por meio de várias alterações genéticas e epigenéticas ⁴. Para estudar os mecanismos da tumorigênese do câncer de mama, sistemas de modelos de camundongos têm sido utilizados devido à sua curta vida útil, tamanho pequeno e rápido tempo de reprodução. Algumas das principais vantagens do uso de modelos de camundongos na pesquisa do câncer são as semelhanças moleculares e fisiológicas que eles compartilham com os humanos ⁵.

Linhagens celulares estabelecidas de camundongos e humanos têm sido amplamente utilizadas na pesquisa do câncer de mama. Embora possamos obter algumas informações sobre as etapas da metástase usando essas células, modelos animais geneticamente manipulados com supressores de tumor / oncogenes fornecerão muito mais informações sobre o desenvolvimento do tumor e metástase a partir do estágio embrionário. Assim, com esses modelos de camundongos, podemos obter regulação genética e de desenvolvimento do crescimento tumoral. Além disso, o microambiente tumoral também desempenha um papel importante na expressão gênica das células tumorais e pode ser difícil mimetizar o mesmo cenário com estudos usando linhagens celulares estabelecidas. Os tumores mamários humanos primários também podem ser usados para estudar a tumorigênese mamária de camundongos. A principal desvantagem do uso de tumores de mama isolados é que esse tumor recém-implantado não possui a vasculatura e o tecido linfático do camundongo. Já os sistemas de modelo genético de camundongos para estudar a tumorigênese mamária nos permitirão monitorar as etapas da metástase, analisar o microambiente tumoral e acessar todo o corpo ⁵.

O objetivo geral deste protocolo é estudar a tumorigênese mamária em camundongos. Sabe-se que os cânceres de mama geralmente metastatizam para o cérebro, pulmão e osso. Este protocolo permite o isolamento de células tumorais mamárias primárias, bem como o estudo da metástase do câncer de mama para o pulmão. Além disso, outro protocolo para análise de fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) do embrião de camundongo está incluído. Juntas, essas técnicas são úteis no estudo da tumorigênese mamária de camundongos.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em ratos de acordo com protocolos aprovados pelo Animal Care Institucional e Comissões de Uso (IACUC) da LSU School of Medicine. Todos os instrumentos devem ser autoclavados antes da dissecção.

1. Preparação de células primárias de tumores de mama mouse

1. Use um modelo de camundongo que foi geneticamente modificada com o mouse mamária Tumor poliomav�us Oriente T-Antigen (mouse MMTV-PyMT-transgênica), que se desenvolvem espontaneamente tumores como descrito anteriormente ^6.
2. Sacrificar os ratinhos com isoflurano (99,9%) e pulverizar etanol 75% para assegurar um ambiente estéril (Figura 1A).
3. Abra a pele a partir da área do orifício uretral para o pescoço com uma tesoura. Pin a pele para baixo para permitir fácil acesso aos órgãos (Figura 1B).
4. Isolar o tumor da mama mamária frio e lava-se com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) (pH 7,4) (Figura 1C).
5. Transferência do tumor auma placa de cultura de 10 centímetros de tecido estéril e cortá-la com uma lâmina de barbear estéril e tesoura para aproximadamente 1 ^mm3 peças. Os passos subsequentes devem ser realizados numa câmara de fluxo laminar estéril.
6. Incubar o tecido tumoral picada com colagenase dissolvido em meio DMEM isento de soro com uma concentração final de 1 mg / ml num agitador rotativo durante 2 horas a 37 ° C. Centrifugar a suspensão do tecido do tumor durante 3 min a 200 x g.
   NOTA: A incubação da colagenase é essencial para a dissociação enzimática do tecido.
7. Descartar o sobrenadante e lavar o precipitado três vezes com PBS (pH 7,4) por centrifugação durante 3 minutos a 200 x g. Após a lavagem final, decanta-se o sobrenadante.
8. Ressuspender o tecido com 2 ml de EDTA de tripsina durante 5 min a 37 ° C, enquanto de nutação. Centrifugar a suspensão durante 3 minutos a 200 xg e repetir as lavagens.
9. Ressuspender o sedimento de tecido em meio de crescimento normal (DMEM, FBS a 10%, 2X pen / strep) numa placa de 10 centímetros. Mudançaa mídia todos os dias para os próximos 3 dias. Células de cultura de células até que o número desejado é obtido.
   NOTA: Aproximadamente 1x10 ⁷ células serão isoladas a partir deste procedimento. Outros modelos tumorigénese mamário de ratinho, tal como MMTV-neu, dar menor rendimento de células quando comparado com MMTV-PyMT. Quando utilizando modelos que produzem um rendimento inferior, é benéfico para começar com um maior células tumorais e de cultura mais longos.

2. Rato Lung Extração de Visualize Lung Metástase

1. Antes da extração do pulmão, do fígado e remover o diafragma. Desalojar as costelas sem perturbar os pulmões.
2. Com um par de tesouras finas, abrir a parte superior da traqueia, que está mais perto da veia jugular.
3. Usando um catéter, injectar um agente, tal como 1 ml de Z-fix ou Índia tinta através da traqueia para encher os pulmões (Figura 2A). Incorporar o Z-fix Pulmões em parafina.
4. De-manchar os pulmões injetados com nanquim em solução de Fekete(100 ml de álcool a 70%, 10 mL de formalina a 10% tamponada, e 5 ml de ácido acético glacial), durante 5 min. Definir nódulos tumorais em locais secundários com um ≥ 0,5 mm de diâmetro, determinar os nódulos como metástase.
   NOTA: Devido ao bloqueio brônquios e bronquíolos pelo tumor, nódulos tumorais não pode absorver 15% da tinta da Índia, e, assim, tecido pulmonar normal será em preto e nódulos tumorais será na cor branca ^7. Isto irá permitir a visualização de nódulos tumorais individuais (Figura 2B).

3. Preparar mouse embrionárias fibroblastos (MEFs) a partir de embriões de camundongos

1. Sacrifício camundongos grávidas com isoflurano (99,9%) e spray de etanol de 75% para garantir um ambiente estéril.
2. Abra a pele a partir da área do orifício uretral para o pescoço com uma tesoura e isolar os embriões do útero.
3. Tenha cuidado para não perturbar os embriões ao abrir a pele.
4. Remova os cornos uterinos e enxaguá-los em ste friorile PBS (pH 7,4).
5. Separa-se a partir de embriões placenta sua muito cuidadosamente e embriões lugar numa placa de 10 centímetros contendo PBS gelado (pH 7,4).
6. Remover a cabeça, fígado e intestino a partir do embrião e colocar a parte restante em uma placa de cultura de tecidos de 12 poços contendo PBS (pH 7,4).
7. Transferir o corpo do embrião para uma outra placa de 12 poços contendo EDTA de tripsina e cortados em pedaços pequenos (~ 1 ^mm3) utilizando uma lâmina de barbear esterilizada e tesoura. Incubar o material cortado com 5 ml de EDTA de tripsina durante 5 min a 37 ° C.
8. Inactivar a tripsina por adição de 1 ml de Soro Fetal Bovino (FBS) para os embriões picados. Centrifugar a suspensão a 200 xg velocidade durante 10 minutos, remover o sobrenadante cuidadosamente, ressuspender o sedimento com 1 ml de meio DMEM morno e transferir todo o conteúdo para um prato de 10 centímetros contendo 10 ml de DMEM (com 20% de FBS e 2X de Penicilina / Estreptomicina ).
9. Mudar a forma todos os dias durante dois dias. Cultura das células até célula desejadanúmero é alcançado.

Resultados

A fase de progressão do tumor em que a sacrificar o animal depende do estudo particular e orientações IACUC. Na Figura 1A, um velho C57BL / 6 do mouse 100 dias com o mouse mamária Tumor poliomav�us Oriente T-Antigen (MMTV-PyMT) foi sacrificado em três meses. A pele foi aberta a partir da área do orifício uretral para o pescoço com as tesouras e a pele foi fixado para baixo para permitir o fácil acesso a órgãos como mostrado na Figura 1B. Isto permitiu um fácil acesso ao tumor que foi ...

Discussão

Este protocolo é para isolar células primárias de um tumor fresco mouse. Os lisados ​​preparados a partir de este método são úteis para a proteína, ADN e análise de ARN. As células cancerosas de tumor da mama primário frequentemente metastizar para o cérebro, pulmão e osso ^1. Inclui-se uma técnica para extrair o pulmão para a detecção de metástases. A coloração do pulmão com uma mancha de tinta vai permitir a visualização dos nódulos tumorais como pode ser visto na Figura 2B. Que fixa os pulm...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	HyClone	SH30243.01	Armazenar em 4 ° C
0,05% Tripsina-EDTA	Tecnologias de vida	25300-062	Armazene em – 20 & deg; C
Colagenase Tipo IV	Sigma-Aldrich	C5138	Loja em – 20 ° C
Hialuronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Loja em – 20 °
C Pen Strep	Life  technologies	15140-122	Loja a 4 & deg; C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106	Armazene em – 80 ° C
Z-fix	ANATECH	#174	Store na RT
India Ink	Yasutomo		Store na RT
AERRANE (Isoflurano)	Baxter	NDC 10019-773-60	Store na RT
Ethanol	EMD	AX0441-3	Store na RT