Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.
Frugten flyve Drosophila melanogaster er en af de førende modelorganismer til at studere funktionen og udviklingen af immunforsvaret. Mange aspekter af medfødte immunitet er bevaret mellem insekter og pattedyr, og da Drosophila let kan genetisk og eksperimentelt manipuleret, de er stærke for at studere immunsystemets funktion og de fysiologiske konsekvenser af sygdommen. Proceduren demonstreret her tillader infektion af fluer ved indføring af bakterier direkte ind i kroppen hulrum, uden epitel barrierer og mere passive former for forsvar og lade fokus på systemisk infektion. Proceduren omfatter protokoller for de måler satser vært dødelighed, systemisk patogen belastning, og graden af induktion af værtens immunsystem. Denne infektion procedure er billig, robust og kvantitativt gentagelig, og kan anvendes i undersøgelser af funktionelle genetik, evolutionære liv historie og fysiologi.
Frugten flyve Drosophila melanogaster er en af de førende modelorganismer til at studere funktionen og udviklingen af immunforsvaret. Drosophila er billige og nemme at opdrætte, er meget modtagelige for eksperimentel manipulation, og er støttet af en omfattende videnskabelige samfund, der har udviklet en bred array af forskningsredskaber. Mange aspekter af medfødte immunitet er bevaret mellem insekter og pattedyr, herunder signaltransduktion medieret af Toll-lignende receptorer og NF-kB familien transkriptionsfaktorer, JAK / STAT signalering og JNK pathway responser. 1,2 Funktionen af disse gener og veje kan forespørges i D. melanogaster hjælp mutationer eller RNAi knockdowns at øge eller mindske pathway aktiviteter 3 -. 6 Derudover Drosophila kan bruges til at studere de fysiologiske konsekvenser af infektion og sygdom, herunder i forbindelse med evolutionære livshistorie teori 7.– 9 Alle sådanne undersøgelser har imidlertid afhænge af evnen til pålideligt inficere eksperimentelle fluer under definerede behandlingsbetingelser. Den her beskrevne fremgangsmåde udgør en metodologisk ramme for at levere robuste og reproducerbare bakterielle infektioner til Drosophila melanogaster og efterfølgende måle infektion sværhedsgrad og kvantificere værtens immunrespons.
Drosophila kan være naturligt og eksperimentelt inficeret med en lang række forskellige parasitter og patogener, herunder bakterier, svampe, vira, nematoder og parasitoid hvepse. Den nuværende protokol er fokuseret på at levere systemisk bakteriel infektion. Mange forskellige bakterier kan bruges til at inficere fluer, og forsøgslederen valg bør baseres på de præcise videnskabelige spørgsmål bliver stillet. For eksempel kan humane kliniske isolater anvendes til at studere bakterielle virulens mekanismer 10, eller økologisk relevante isolater kan være preferred for evolutionære studier. 11 Nogle bakterier er kompetente patogener af D. melanogaster, prolifererende ved infektion og forårsager host sygdom eller død. Andre bakterier effektivt forvaltes af værtens immunsystem og ryddet i løbet af få dage. I denne demonstration vil Providencia rettgeri anvendes som en proliferativ patogen, der kan forårsage vært dødelighed og vedvarer i overlevende værter. Escherichia coli vil blive anvendt som en ikke-patogen, der er godkendt af værtens immunsystem.
Infektioner bliver etableret ved indføring af bakterier direkte ind i kroppen hulrum af fluen. Denne fremgangsmåde omgår epitelbarrierer og beskyttende adfærd, så undersøgelse af systemisk infektion uanset naturlige smittemåde. Der er to primære fremgangsmåder til eksperimentelt oprettelse systemisk infektion. I den første, en nanoinjector og trukket glas kapillar nåle anvendes til at injicere et præcist antalbakterier i fluen. Denne fremgangsmåde har fordelene ved at tillade et stort dynamisk område på infektion doser og ved at være kvantitativt meget gentagelig. Den anden tilgang er at levere infektion med en septisk nålestik. Denne fremgangsmåde har fordelene ved at være hurtig og kræver ikke særligt udstyr. Når infektioner er etableret, bliver det muligt at måle systemiske patogen belastning, host dødelighed, og inducerbare immunsystem-aktivitet. Selvfølgelig kunne tænkes ikke måles række yderligere fænotyper i inficeret D. melanogaster, herunder post-infektion frugtbarhed 12, indlæringsevne 13, metabolisk status 14 eller stort set enhver anden træk, der kan forestille sig.
Den her beskrevne fremgangsmåde giver streng og høj kvalitet infektion af Drosophila melanogaster. De viste eksempler primært fokuseret på infektion med Providencia rettgeri og E. coli, men protokollen er meget fleksibel og kan anvendes til infektioner med forskellige bakterier over et interval af vært opdræt og vedligeholdelse betingelser.
Detaljerne i en optimal eksperimentelle fremgangsmåde vil afhænge af den bakterie, der anvendes til infektion, genotypen af værten, og de overordnede eksperimentelle betingelser. Det anbefales kraftigt at pilottest nye eksperimentelle betingelser inden initiering mere ambitiøse projekter. Et godt udgangspunkt er at teste tre infektion doser over en 100-fold rækkevidde. Stærkt virulente patogener er ofte bedst indføres ved meget lave infektiøse doser, i størrelsesordenen 10 til 100 bakterieceller pr flue. Mere moderate patogener kan injiceres ved højere doser af omkring 1.000 bakterier pr fly og ikke-patogener kan injiceres ved doser så høje som 10.000 bakterier pr flue. Det er ofte lærerigt at definere kinetikken af hidtil ukendte infektioner ved at spore patogen belastning, host dødelighed, og immunsystemet aktivitet i en serie langsgående tid. Fordi målingen af patogen belastning og vært genekspression er destruktive analyser, er det nødvendigt at inficere forskellige fluer ved starten af forsøget for hver gang punkt, der skal måles.
Når det besluttes, om at bruge nålestik eller mikrokapillære-baserede injektion, er det vigtigt at bemærke at der er fordele og begrænsninger for hver tilgang. Kapillær injektion indfører en mængde væske i fluen, som både øger i beskedent omfang saftspændingen og indfører salte eller andre molekyler, der er suspenderet eller opløst i bæreren. Kapillær injektion kræver også adgang til en injektion facilitet eller køb af det nødvendige udstyr. Septisk nålestik kræver ikke særligt udstyr og introducererubetydelige medie i fluen, og typisk er mere effektiv for at inficere et stort antal fluer. Men nålestik infektioner ikke tillade præcis kontrol over infektion dosis, der kan opnås med kapillær injektion. Den foreliggende protokol fokuserede på et injektionsapparat, der mekanisk regulerer injektionsvolumen, men der er også indsprøjtningssystemer baseret på diskrete pulser af trykluft. 20,21 Disse er typisk dyrere end apparatet featured her og kræver kalibrering af luft impuls til hver nål for at sikre ensartede injektionsvolumener.
Der er stor debat, men meget få data om, hvordan fluerne bliver systemisk inficeret med bakterier i naturen. Nogle forskere postulere, at størstedelen af naturlige infektioner opstår, når Drosophila indtage sygdomsfremkaldende bakterier og bakterier er efterfølgende i stand til at undslippe tarmen til at etablere en systemisk infektion. Der er imidlertid meget few bakterier, der vides at være i stand til at krydse tarmen af D. melanogaster, og dem, der har denne evne er meget dødelige for fluer 22,23. En alternativ teori er, at flyver jævnligt opretholde kutikulære skader gennem flugt fra mislykkede prædation forsøg eller angreb af ektoparasitiske mider. Denne hypotese understøttes af hyppig indsamling af vilde D. melanogaster bærende melanin pletter, der er betegnende for helede sår (upublicerede observationer). Mider er blevet vist at transmittere bakterieinfektioner i Drosophila 24 og sår efterladt af mider kan sekundært inficeret af bakterier i honningbier 25. Frekvensen i naturen af mide-drevet eller på anden måde opportunistisk infektion af D. melanogaster gennem neglebånd brud er ikke kendt. Den her beskrevne protokol tillader indføring af bakterier direkte i hæmolymfe gennem kvantitative injektion, der omgår de epiteliale barrierer eller adfærdsmæssige IMMUskabet. Fremgangsmåder til tilførsel af patogene bakterier til D. melanogaster er blevet beskrevet i Vodovar et al. 22 og nehme et al. 23.
Mange entomopatogene bakterier udgør en lille eller ingen fare for menneskers sundhed, så forskerne at arbejde med dem komfortabelt. Ydermere giver meget få bakterier har evnen til at inficere Drosophila ved kontakt uden eksperimentel indgriben, så risikoen for "epidemi" spredning af bakteriel infektion gennem et laboratorium via kontaminerede overflader eller undslupne fluer er generelt meget lav. Ikke desto mindre, er det tilrådeligt at sikre, at tilstrækkelige indeslutningsforanstaltninger er på plads for at forhindre inficerede fluer i at slippe ud og for at genvinde eventuelle undslap fluer. Laboratoriet skal være udstyret med et biologisk sikkerhedsniveau i et rimeligt forhold, at af de patogener, der anvendes, og standard bedste praksis i mikrobiologi bør anvendes.
Den eksperimentelle infectiom metoden beskrevet her tillader infektioner af Drosophila melanogaster med enhver dosis af vilkårlig bakterie. Når der er etableret infektion, er det ligetil at måle kinetikken af bakteriel proliferation eller clearance, til at spore vært dødelighed, og til analyse induktion af værtens immunsystem. Inficerede fluer kan let blive udsat for andre fænotypiske analyser, herunder test af fysiologiske funktioner, der kan forme eller være formet af infektionen. De beskrevne procedurer er billig, kræver relativt lidt specialudstyr, og er let læres, hvilket gør dem medgørlige til brug i forskellige projekter på tværs af en bredde af forskning og undervisning laboratorier.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank the entire Lazzaro lab, and especially Susan Rottschaefer, for their help in both reviewing and testing these protocols. This is a product of their cumulative expertise. Work in the Lazzaro lab is supported by grants R01 AI083932 and R01 AI064950 from the US National Institutes of Health.
Reagent | Company | Part Number |
Incubator | Powers Scientific, Inc | DROS52SD |
Paintbrush | ||
CO2 Flypads | FlyStuff | 59-114 |
CO2 | Airgas | CD FG50 |
Drosophila rearing mix | ||
6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 |
Nosterile Extra Large Cotton Balls | Fisher brand | 22-456-882 |
Microscope | Olympus Corporation | SZ51 |
Drosophila Vials polystyrene | VWR international | 89092-720 |
Nosterile Large Cotton Balls | Fisher brand | 22-456-883 |
2L flask | VWR international | 89000-370 |
Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 . x 15 mm; | VWR international | 25384-302 |
LB Agar, Miller | Difco | 244520 |
Innoculing Loop | VWR international | 80094-488 |
Rainin Clasic Pipettes in various sizes 0.1 µl to 2 µl, 2 µl to 20 µl, 20 µl to 200 µl, 100 µl to 1000 |
Rainin | PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000 |
Micropipette tips (assorted sizes) | VWR international | 30128-376 53503-810 16466-008 |
Luria Broth Base, Miller | Difco | 241420 |
Disposable Culture Tubes Borosilicate Glass | VWR international | 47729-576 |
S-500 Orbital Shaker | VWR international | 14005-830 |
centrifuge | VWR international | 37001-300 |
PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 |
SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 |
Semimicrovolume Cuvettes | Bio-Rad | 223-9955 |
Vertical Capillary Puller | Kopf Needle Pipette Puller | |
3.5'' Replacement glass Capillaries for Nanojet II | Drummond Sientific Company | 3-000-203-G/X |
Nanoject II | Drummond Sientific Company | 3-000-204 |
Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
10mL Syringe | BD | 309604 |
Mineral Oil, White, light | Macron Fine Chemicals | 6358-10 |
minutein pins | Fine Science Tools | 26002-10 |
1.5mL Microcentrifuge tubes; Seal Rite | USA Scientific Inc. | 1615-5500 |
Motorized Pestle; Talboys Laboratory Stirrer | Troemner | 103 |
Talboys High Throughput Homogenizer | OPS Diagnostics | 930145 |
5/32'' Grinding Balls | OPS Diagnostics | GBSS 156-5000-01 |
Vortex Genie | Scientific indurstries inc. | G560 |
Multichannel Pipettor (10uL-300uL) | Sartorius | 730360 |
WASP2 Whitley Automated Spiral Plater | Microbiology International | |
ProtoCOL automated colony counter / plate counter/ plate reader | Microbiology International | |
TRIzol | Life Technologies | 15596-026 |
qPCR tubes; Low-Profile 0.2 ml 8-Tube Strips | Bio-Rad | TLS0801 |
qPCR caps; Optical Flat 8-Cap Strips | Bio-Rad | TCS0803 |
RQ1 RNase-Free DNase | Promega | m610a |
M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | m170b |
dNTPs | Promega | U1240 |
Oligo-dT | IDT | |
SsoAdvanced SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5260 |
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5200 |
RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2115 |