Um método simples e barato para a determinação da sensibilidade Fria e Adaptação no Mice

Summary

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 °C and 5 °C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Abstract

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.

Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 °C to 5 °C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.

This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Introduction

Medir a capacidade de resposta fria em roedores é importante para melhorar a compreensão dos potenciais mecanismos de sensibilidade frio em seres humanos, tanto em condições normais e patológicas. The Cold Plantar Assay (CPA), originalmente desenvolvido há vários anos ^um, é projetado para gerar, respostas inequívocas murino comportamentais reprodutíveis a um estímulo frio entregue na RT. Mais recentes melhorias deste ensaio permitiu a medida reprodutível de sensibilidade frio a uma vasta gama de temperaturas ^{de 2.} Ambas as versões também são projetados para ser relativamente alto rendimento, e barato de usar.

Uma grande quantidade de progresso tem sido feito na compreensão dos mecanismos de sensibilidade frio usando outros métodos comportamentais. Um método é o teste de evaporação de acetona, enxugando ou que envolve a pulverização acetona na pata do rato e medindo a quantidade de tempo que o rato gasta sacudindo a ^3,4 pata. Infelizmente,as respostas a acetona evaporação são confundidos pela sensação molhada e o cheiro da acetona. Além disso, o estímulo frio que é aplicado no teste de acetona evaporação pode variar de acordo com a quantidade de acetona aplicada, e é difícil de quantificar. Finalmente, os ratinhos lesionados têm respostas mínimas para acetona a linha de base, o que torna impossível de medir a analgesia na ausência de hipersensibilidade com este método.

Outro ensaio clássico para respostas frias é o ensaio da ponta da cauda, ​​onde a latência para retirada é medida após a cauda está imerso em ^5,6 água fria. Enquanto as respostas comportamentais neste ensaio são inequívocos e o ensaio mede as respostas a uma temperatura específica, os animais devem ser imobilizados durante os testes, o que pode alterar a capacidade de resposta fria através bem descritos mecanismos analgésicos estresse induzido por ^7.

Outra ferramenta utilizada é o teste de placa fria, que mede o comportamentorespostas dos ratos depois de serem colocados sobre uma placa arrefecida com Peltier ^8-10. Enquanto esta ferramenta fornece informações sobre as respostas de animais em temperaturas específicas, ele também tem sido usado de forma inconsistente; diferentes grupos foram medidos diferentes tipos de resposta incluindo o número de saltos ^8,11, a latência a primeira resposta ^{8,11- 13,} e o número de pata elevadores ^11,13,14 com resultados muito diferentes. O teste de placa de frio é também relativamente baixa taxa de transferência uma vez que apenas um animal pode ser testada ao mesmo tempo, e necessitam de um dispositivo de Peltier caros e frágeis.

O teste de preferência temperatura 2 placa é um derivado normalmente usado para o teste de placa fria, que mede a quantidade relativa de tempo em que os animais passam em 2 placas conectadas de diferentes temperaturas ^{9,15- 17.} Outro ensaio utilizado é semelhante ao ensaio de gradiente térmico, em que a quantidade de tempo que os ratos passam em diferentes zonas de temperaturavariando entre 5 ° C e 45 ° C em uma placa de metal é medida a longo ^16. Enquanto estes ensaios permitir a comparação das temperaturas, não está claro se o comportamento representa aversão temperatura ou a preferência de temperatura.

Finalmente, o ensaio de placa fria dinâmica tem sido usado para medir como ratos responder às mudanças nas temperaturas ambiente ^18. Este método envolve a colocação de ratos em um dispositivo Peltier RT e aumentando-a para 1 ° C enquanto mede o quanto os ratos saltar ou lamber as patas em diferentes temperaturas de placas. Enquanto isto testa como ratos se adaptar a um ambiente de arrefecimento, ele não fornece uma maneira de testar como os ratos responder a um estímulo frio na definição de uma temperatura ambiente mais fresco. Além disso, requer equipamentos caros para realizar e não fornece uma maneira de se aclimatar ratos para o equipamento de teste antes de medir a sua sensibilidade frio.

Para complementar estes ensaios, o CPA testa a ACCLIMAted respostas a um estímulo frio bem definida em uma variedade de faixas de temperatura, ou durante o processo de adaptação a temperaturas ambientes frios. Pode testar-se a 14 ratinhos de cada vez com o nosso aparelho actual, com o potencial de ser barata aumentada a escala para ensaios de elevado rendimento.

Protocol

Todos os protocolos de mouse estavam de acordo com os institutos nacionais de saúde e orientações foram aprovadas pelo Comitê de animal Estudos da Escola de Medicina da Universidade de Washington (St. Louis, MO). 1. Preparando a Placa e Recintos Testing Limpar a superfície do vidro. Segurar a sonda termopar filamento do tipo T à superfície no meio da placa de vidro com fita adesiva de laboratório. Colocar o animal independente sobre a placa de vidro em …

Representative Results

As respostas comportamentais induzidos de ratinhos a partir de 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, e 12 ° C são altamente reprodutível (Figura 4A) 20. A fim de medir o estímulo frio sendo gerado sob a pata traseira, os ratos foram anestesiados com uma mistura de cetamina / xilazina / acepromazina e cocktail suas patas foram assegurados no vidro na parte superior de um termopar de tipo T filamento (Figura 4B) 20. O vidro foi arrefecida ou aquecida para a faixa de teste d…

Discussion

The CPA can be used to assess cold sensitivity and cold adaptation in mice. It provides an affordable, efficient way to measure cold responses in unrestrained, acclimated animals at a wide variety of temperature ranges. It also provides an unambiguous behavioral response with an easily quantified and analyzed output variable. It has already been used to assess changes in cold sensitivity induced by inflammation¹, neuropathic injury¹, analgesics¹, genetic knockouts²⁰, and ge…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
T-type thermocouple probe	Physitemp	IT-24p	Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate	Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc)	N/A	We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger	Extech	EA15	Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3mL Syringe	BD	309657	The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer	If using Extech logger, any Pcwill work	N/A
Aluminum boxes	Washington University in St. Louis machine shop	N/A	boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator	VWR		Any water circulator model with a pump will work
21 gauge needle	BD	305165	The exact needle size is not important
Hand timer	N/A		Any hand timer will work
Mirror	N/A		Any flat mirror will work