3'LIFE의 분석을 사용하여 높은 처리량 miRNA의 표적의 탐지
Summary
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Abstract
3'UTRs의 기능 요소의 발광 식별 (3'LIFE는) 쿼리 3'UTRs 수백의 배열 내의 특정의 miRNAs의 목표의 신속한 식별 할 수 있습니다. 대상은 식별 된 miRNA 타겟팅의 판독 기능을 제공 병진 출력을 측정함으로써 mRNA의 수준에서 결합 검출 듀얼 루시퍼 라제 분석에 기초한다. 3'LIFE은 게놈 와이드 화면을 비 독점 버퍼 및 시약, 그리고 공개적으로 사용할 수 기자 라이브러리를 사용 가능하고 비용 효율적인. 3'LIFE 표준 실험실 환경에서 수행 중 또는 액체 처리 로봇 및 기타 높은 처리량 장비를 사용하여 확장 할 수 있습니다. 우리는 인간의 96 웰 플레이트에 복제 3'UTRs, 2 개의 시험의 miRNAs의 데이터 집합을 사용하는 방법을 설명, 렛 7C 미르-10B. 우리는 96 웰 형식 DNA 준비, 형질 전환, 세포 배양 및 루시퍼 라제 분석을 수행하고, 데이터를 툴을 제공하는 방법을 보여분석. 결론적으로 3'LIFE 매우 재현 신속하고 체계적이며, 높은 신뢰성 목표를 식별합니다.
Introduction
이 방법의 전체 목표는 정확히 감지하고 높은 처리량에서 마이크로 RNA (miRNA의) 대상을 매핑하는 것이다. 의 miRNAs는 ~ 길이 22 뉴클레오티드 내인성 비 코딩 RNA를합니다. 전사 처리에 따라, 성숙의 miRNAs는 단백질 복합체에 포함되는 복잡한 (RISC)를 침묵 유도 된 RNA를했다. 각각의 miRNA는 번역 억압 또는 mRNA의 절단 1 중 하나의 결과로, 주로 메신저 RNA를의 '비 번역 영역 (3'UTRs) (의 mRNA를)에있는 요소를 대상으로 RISC를 안내합니다. U는 염기쌍을 동요하고있다 퇴화를 자연에서 여러 일치하지 않는 염기 쌍을 포함하는 지역을 불룩 : miRNA의 표준 왓슨 – 크릭 및 G에 기초하여 대상 사이트를 인식하고 있습니다. 대부분의 miRNAs는 크게 그들이 생물학적 역할의 다양한 범위를 재생할 인간 2,3에 식물에서 보존된다. 후생 동물에서의 miRNA는 세포의 운명 결정 4, 발달시기 (5) 등 다양한 생물학적 과정에 영향을 미칠 수있다 </sup> 자주 조직 특이 적 발현 양상 6,7을 나타낸다. 의 miRNA misexpression 또한 표적 유전자의 기능만을 기준 셀의 동작에 상당한 영향을 미칠 수있는 비정상적인 유전자 조절, 발생할 수있다. 이와 같이, 신경 퇴행의 miRNAs는 8,9, 당뇨병, 암 (10) (11)을 포함하여 다양한 질환에 연결되어있다. 생물 정보학 및 습식 벤치 방법은 각각의 miRNA는 높은 처리량 또는 게놈 넓은 접근 방식이 잠재적 인 상호 작용이 큰 풀을 조사하는 데 필요한 것을 나타내는 별개의 mRNA 12-14 수천 수백을 대상으로 할 수 있음을 시사한다.
표적 유전자를 확인하는 것은 기계적으로 정의 miRNA의 기능의 중요한 요소이며, 그렇게 연구자 대규모 타겟을 계시 할 수 있어야한다. 몇몇 접근법은 생물 정보학적인 예측 알고리즘을 포함하여 miRNA의 타겟을 식별하기 위해 개발 된, 높은 처리량 시퀀싱의 mRNA를 표적으로하고, 기자가 분석을 기반으로. 이러한 접근 방식은 각각 고유의 강점과 약점을 가지고있다. miRNA의 타겟팅이 순서 특이성에 의해 인도되는 것을 감안할 때, 특히 뉴클레오티드의 miRNA의 2-6의 여러 알고리즘은 많은 생물의 게놈을 통해 miRNA의 목표를 예측하기 위해 개발되었다 (시드 지역을 지칭). 이 알고리즘은 검증의 miRNA 대상의 관찰베이스 페어링 모티브를 사용하여 훈련, 자주 등의 엄격한 씨 페어링, 현장 보존 및 / 또는 열역학적 안정성 15 매개 변수를 사용하고 있습니다. 이러한 필터는 단지 높은 신뢰 대상에 충분한 상보성을 가진 추정 대상의 다수를 구체화 반면, 최근 증거는 16-24 만연 시사 종 특이적이고 비정규의 miRNA 표적 부위를 제외 할 수있다. 더욱이,이 예측은 이러한 대안 폴리아 데 닐화와 같은 miRNA의 표적 부위를 제외 mRNA의 계정 처리 메커니즘을 고려하지 않는다25, RNA 편집 (26), RNA 메틸화 (27), 협력 바인딩. 따라서, 높은 위양성과 위음성 율은 많은 알고리즘 22,24,28보고되고있다. 이러한 알고리즘은 후속 실험 검증을 위해 후보 miRNA의 타겟을 식별하는 데 유용하지만, 이러한 높은 에러율 체계적인 miRNA의 타겟 검출을위한 생물 정보학적인 방법의 유효성을 제한한다.
체계적으로 특정 miRNA의 사이의 상호 작용 및 잠재적 대상 3'UTRs에 대해 조사하기 위해 우리는 3'UTRs (3'LIFE) 24 기능 요소의 발광 식별라는 높은 처리량 분석을 개발했습니다. 상기 분석 수단의 상호 작용과 직접 이중 루시페라아제 리포터 시스템을 이용하여 miRNA의 쿼리 테스트 3'UTR의 병진 억압. 이 시스템에서, 관심의 유전자의 3'UTR은 개똥 벌레 루시퍼 라제 (fluc) 리포터 판독 프레임의 하류에 클로닝된다. 기자의 단점truct는 HEK293T 세포에서 쿼리의 miRNA에 동시 형질 감염된된다. miRNA의 타겟팅 테스트 fluc :: 3'UTR 기자와 제 비특이적 레 닐라 루시퍼 라제 리포터의 상대적인 변화를 측정함으로써 결정된다. 중요한 것은, 루시 페라 제 분석은 기자의 병진 출력에 영향을 미치는 기능의 miRNA / mRNA의 상호 작용을 검출한다. 이는이 3'UTR 기반 규제의 독립적 인 단백질 풍부 mRNA의 분해와 번역 억압의 차이뿐만 아니라, 변화를 무시, 이러한 RT-qPCR에 서양 말과 같은 miRNA의 규제를 감지하는 기존의 방법에 비해 큰 장점이다.
루시페라아제 분석법 널리 소모성 시약과 관련된 높은 비용에 의해 제한되기 때문에 상대적 단순성과 감도이면서 높은 처리량 스크린에서 그 사용 직접적인 miRNA의 대상을 확인하는 데에 이용되는, 공개 출처 3'UTR 라이브러리의 부족, 부재 표준화 된 루시 페라 제 제자의ocols, 여러 데이터 세트에 걸쳐 기능 억압 비교에 어려움을 선도. 3'LIFE 분석의 사용을 용이하게하기 위해, 우리는 정기적으로 업데이트 팽창 3'UTR 라이브러리를 만들어 실험 설계 비상업적 형질 24 루시퍼 라제 시약 (29)의 이용의 간소화에 중점을 넣고,를 통해 사용할 수있다 공개 플라스미드 저장소 (30).
3'LIFE 분석의 확장 성 bioinformatically 확인 된 유전자으로 화면을 바이어스없이 특정 miRNA의 타겟팅에 대한 큰 3'UTR 라이브러리의 검사를 할 수 있습니다. 정규 예측과 상호 작용을 시험 이외에, 체계적인 접근법 비정규 및 / 또는 종 특이 적 상호 작용을 통해 구동되는 신규 대상의 식별을 허용한다. 중요한 단백질 생산에 타겟팅 된 miRNA의 효과는 일반적으로 적당한 병진 억압 15,31 <발생하는 것으로 이해된다/ SUP>, miRNA의 규제의 주요 역할, 단백질 출력 미세 조정 유전자 발현의 비정상적인 수준을 방지하고, 특정 프로그램 (32, 33)를 셀에 견고 함을 제공하는 것을 제안. 3'LIFE 화면에 음의 miRNA / mRNA의 상호 작용의 본질적으로 다수의 결합 루시페라아제 분석의 민감도의 miRNA 유전자의 다수의 타겟팅의 미묘한 효과를 검출하고, 유전자 네트워크의 여러 구성 요소들의 식별을 허용하는 특정 miRNA의 (24)에 의해 조절된다.
여기에서 우리는 3'LIFE 프로토콜을 설명하고 275 인간 3'UTRs (그림 1)의 패널에 대해이 잘 특성화의 miRNAs 미르-10B 및하자-7C를 선별하여이 가능성의 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
3'LIFE 분석은 높은 처리량에 3'UTRs에 기능 miRNA의 목표를 식별합니다. 이 분석은 실험적으로 관심에 대한 자신의 miRNA 추정 대상의 다수를 식별 할 목적으로 연구에 유용하다. 3'LIFE 분석은 분석이 miRNA의 타겟팅의 기능 측정, 자신있게 해결할 수있는 하나의 miRNA에 대한 3'UTR :: 단일 기자의 이진 테스트를 제공한다는 점에서 3'UTR 중심의 규제를 조회 할 수있는 강력한 방법이다 개별 유?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Materials
| Reagents | ||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| ATP | Sigma | FLAAS |
| DTT | Sigma | D0632 |
| MgSO4 | Sigma | M7506 |
| CoA | Sigma | C4282 |
| luciferin | Sigma | L9504 |
| NaCl | Sigma | S7653 |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 |
| BSA | Sigma | A2153 |
| NaN3 | Sigma | S2002 |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| FBS | Sigma | F2442 |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 |
| Trypsin | T2600000 | |
| Consumables | ||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 |
| Instruments | ||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
Referências
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
- Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
- Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
- Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
- Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
- Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
- Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3’UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
- Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to ‘seedless’ 3’UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
- Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
- Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
- Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).
- Chen, J., et al. miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma. Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).
- Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
- Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).
- Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3’LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
- Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3’UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
- Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3’UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204 (2013).
- Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
- Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
- Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).
