3'LIFE परख का उपयोग उच्च throughput में miRNA लक्ष्य की जांच
Summary
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Abstract
3'UTRs में कार्यात्मक तत्वों का Luminescent पहचान (3'LIFE) पूछे 3'UTRs के सैकड़ों की एक सरणी के भीतर विशिष्ट miRNAs की लक्ष्य की तेजी से पहचान की अनुमति देता है। लक्ष्य की पहचान miRNA को निशाना बनाने का एक कार्यात्मक readout दे रही है, translational उत्पादन को मापने के द्वारा mRNA के स्तर पर बाध्यकारी पता लगाता है दोहरे luciferase परख, पर आधारित है। 3'LIFE जीनोम चौड़ा स्क्रीन बनाने गैर मालिकाना buffers और अभिकर्मकों, और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध संवाददाता पुस्तकालयों का उपयोग करता है संभव है और लागत प्रभावी है। 3'LIFE एक मानक प्रयोगशाला की स्थापना में या तो प्रदर्शन किया या तरल से निपटने रोबोट और अन्य उच्च throughput उपकरण का उपयोग को बढ़ाया जा सकता है। हम मानव 96 अच्छी तरह से प्लेट में क्लोन 3'UTRs, और दो टेस्ट miRNAs की एक डाटासेट का उपयोग कर दृष्टिकोण को वर्णन, जाने-7C और मीर-10b। हम 96 अच्छी तरह प्रारूप में डीएनए तैयारी, अभिकर्मक, सेल संस्कृति और luciferase assays के प्रदर्शन, और डेटा के लिए उपकरण उपलब्ध कराने के लिए प्रदर्शनविश्लेषण। अंत में 3'LIFE अत्यधिक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तेजी, व्यवस्थित है, और उच्च आत्मविश्वास लक्ष्यों की पहचान करता है।
Introduction
इस विधि के समग्र लक्ष्य का पता लगाने और ठीक उच्च throughput में माइक्रो RNA (miRNA) के लक्ष्यों को मैप करने के लिए है। MiRNAs ~ लंबाई में 22 न्यूक्लियोटाइड अंतर्जात गैर-कोडिंग RNAs हैं। प्रतिलेखन और प्रसंस्करण के बाद, परिपक्व miRNAs एक प्रोटीन परिसर में शामिल कर रहे हैं जटिल (RISC) मुंह बंद करने के लिए प्रेरित शाही सेना को बुलाया। प्रत्येक miRNA के अनुवाद दमन या mRNA दरार 1 या तो है, जिसके परिणामस्वरूप मुख्य रूप दूत RNAs के 3'untranslated क्षेत्रों (3'UTRs) (mRNAs) में स्थित तत्वों को लक्षित करने के लिए RISC मार्गदर्शन करता है। यू आधार बाँधना लड़खड़ा रहे हैं, और पतित प्रकृति में, कई बेमेल आधार जोड़े युक्त और क्षेत्रों bulged: Mirna मानक वाटसन-क्रिक और जी के आधार पर लक्ष्य साइटों को पहचानते हैं। कई miRNAs मोटे तौर पर वे जैविक भूमिकाओं में से एक विविध रेंज खेलने जहां मनुष्य 2,3, पौधों से संरक्षित कर रहे हैं। मेटाजोअन में miRNAs सेल भाग्य का निर्णय 4, विकासात्मक समय 5 सहित कई जैविक प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं </sup>, और अक्सर ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न 6,7 दिखा रहे हैं। Mirna misexpression भी लक्ष्य जीन के समारोह पर पूरी तरह आधारित सेल व्यवहार पर काफी प्रभाव पड़ सकता है, जो न्यायपालिका जीन विनियमन, में परिणाम कर सकते हैं। जैसे, miRNAs neurodegeneration 8,9, मधुमेह और कैंसर के 10 से 11 सहित रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला से जुड़ी हैं। पहले से पंजीकृत है और गीला-बेंच दृष्टिकोण प्रत्येक miRNA के उच्च throughput या जीनोम विस्तृत दृष्टिकोण संभावित बातचीत के इस बड़े पूल की जांच के लिए आवश्यक हैं यह दर्शाता है कि अलग mRNAs 12-14 के हजारों सैकड़ों को लक्षित करने में सक्षम हो सकता है कि सुझाव।
लक्ष्य जीन की पहचान mechanistically को परिभाषित miRNA समारोह का एक महत्वपूर्ण घटक है, और ऐसा करने के लिए शोधकर्ताओं ने एक बड़े पैमाने पर लक्ष्य प्रकट करने के लिए सक्षम होना चाहिए। कई दृष्टिकोण पहले से पंजीकृत भविष्यवाणी एल्गोरिदम सहित miRNA लक्ष्यों की पहचान करने के लिए विकसित किया गया है, उच्च throughput अनुक्रमणके mRNAs को निशाना बनाया, और संवाददाता assays के आधार पर। इन तरीकों में से प्रत्येक निहित शक्तियों और कमजोरियों है। MiRNA लक्ष्य-निर्धारण अनुक्रम विशिष्टता द्वारा निर्देशित है यह देखते हुए कि, सबसे विशेष रूप से न्यूक्लियोटाइड miRNA की 2-6 की, कई एल्गोरिदम कई जीवों के जीनोम भर miRNA लक्ष्य भविष्यवाणी करने के लिए विकसित किया गया है (बीज क्षेत्र कहा जाता है)। इन एल्गोरिदम मान्य miRNA लक्ष्य का मनाया आधार बाँधना रूपांकनों का उपयोग करने के लिए प्रशिक्षित है, और अक्सर इस तरह के कड़े बीज बाँधना, साइट संरक्षण, और / या Thermodynamic स्थिरता के रूप में 15 मापदंडों का उपयोग कर रहे हैं। इन फिल्टर केवल उच्च आत्मविश्वास लक्ष्य के लिए पर्याप्त पूरकता के साथ ख्यात लक्ष्य की बड़ी संख्या को परिष्कृत करते हैं, वे हाल ही में सबूत 16-24 बड़े पैमाने पर कर रहे हैं, जो पता चलता प्रजातियों विशिष्ट और गैर विहित miRNA लक्ष्य साइटों, बाहर कर सकते हैं। इसके अलावा, इन भविष्यवाणियों ऐसे वैकल्पिक polyadenylation के रूप में miRNA लक्ष्य साइटों, बाहर करते हैं कि mRNA के प्रसंस्करण के खाते तंत्र में नहीं लेते25, आरएनए संपादन 26, शाही सेना मिथाइलेशन 27, और सहकारी बंधन। जैसे, उच्च झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी दरों कई एल्गोरिदम 22,24,28 के लिए सूचित किया गया है। इन एल्गोरिदम बाद प्रायोगिक सत्यापन के लिए उम्मीदवार miRNA लक्ष्यों की पहचान करने के लिए उपयोगी होते हैं, इन उच्च त्रुटि दर व्यवस्थित miRNA लक्ष्य का पता लगाने के लिए पहले से पंजीकृत दृष्टिकोण की प्रभावकारिता को सीमित।
योजनाबद्ध तरीके से एक दिया miRNA के बीच बातचीत और संभावित रूप से लक्षित 3'UTRs के लिए जांच करने के लिए हम 3'UTRs (3'LIFE) 24 में कार्यात्मक तत्वों का Luminescent पहचान नामक एक उच्च throughput परख विकसित किया है। यह परख उपायों प्रत्यक्ष बातचीत और एक दोहरी luciferase संवाददाता प्रणाली का उपयोग करते हुए एक क्वेरी miRNA द्वारा परीक्षण 3'UTR के translational दमन। इस प्रणाली में, ब्याज की एक जीन की 3'UTR जुगनू luciferase (fluc) संवाददाता पढ़ने फ्रेम के बहाव के क्लोन है। संवाददाता विपक्षtruct HEK293T कोशिकाओं में एक क्वेरी miRNA के साथ cotransfected है। Mirna लक्ष्य-निर्धारण परीक्षण fluc :: 3'UTR रिपोर्टर और एक दूसरे गैर विशिष्ट Renilla luciferase संवाददाता के बीच सापेक्ष परिवर्तन को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है। महत्वपूर्ण बात है, luciferase assays के रिपोर्टर के translational उत्पादन को प्रभावित करने वाले कार्यात्मक miRNA / mRNA के बातचीत का पता लगाने। मतलब यह है कि इस 3'UTR आधारित विनियमन के स्वतंत्र प्रोटीन बहुतायत में mRNA गिरावट और translational दमन में मतभेद है, साथ ही परिवर्तन नजरअंदाज में, इस तरह के आर टी-qPCR और पश्चिमी दाग के रूप में miRNA के विनियमन, पता लगाने के लिए पारंपरिक तरीकों के ऊपर एक महत्वपूर्ण लाभ है।
Luciferase assays के लिए व्यापक रूप से उपभोज्य अभिकर्मकों के साथ जुड़े उच्च लागत द्वारा सीमित है क्योंकि उनके रिश्तेदार सादगी और संवेदनशीलता, अभी तक उच्च throughput स्क्रीन में उनके उपयोग के प्रत्यक्ष miRNA लक्ष्य को मान्य करने के लिए उपयोग किया जाता है, सार्वजनिक स्रोतों से 3'UTR पुस्तकालयों की कमी है, और अभाव मानकीकृत luciferase prot कीocols, कई डेटासेट भर में कार्यात्मक दमन की तुलना में कठिनाइयों के लिए अग्रणी। 3'LIFE परख के उपयोग की सुविधा के लिए, हम नियमित रूप से अद्यतन और विस्तारित किया है, जो एक 3'UTR पुस्तकालय बनाने, प्रयोगात्मक डिजाइन, गैर वाणिज्यिक अभिकर्मक 24 और luciferase अभिकर्मकों 29 के उपयोग के सरलीकरण पर जोर दिया है, और के माध्यम से उपलब्ध है एक सार्वजनिक प्लाज्मिड रिपोजिटरी 30।
3'LIFE परख के scalability bioinformatically पहचान जीन की ओर स्क्रीन biasing बिना किसी दिए गए miRNA द्वारा लक्षित करने के लिए एक बड़ी 3'UTR पुस्तकालय की स्क्रीनिंग की अनुमति देता है। विहित और भविष्यवाणी की बातचीत का परीक्षण करने के अलावा, इस व्यवस्थित दृष्टिकोण गैर विहित और / या प्रजातियों विशिष्ट बातचीत के माध्यम से संचालित उपन्यास लक्ष्यों की पहचान की अनुमति देता। महत्वपूर्ण बात है, प्रोटीन के उत्पादन पर लक्षित कर miRNA के प्रभाव आम तौर पर मामूली translational दमन 15,31 <परिणाम में समझा जाता है/ Sup>, miRNA के विनियमन के एक प्राथमिक भूमिका, प्रोटीन उत्पादन ठीक धुन जीन अभिव्यक्ति की न्यायपालिका के स्तर के खिलाफ की रक्षा, और विशिष्ट कार्यक्रमों 32,33 सेल मजबूती प्रदान करने के लिए है कि सुझाव दे। 3'LIFE स्क्रीन में नकारात्मक miRNA / mRNA के बातचीत के स्वाभाविक बड़ी संख्या के साथ संयुक्त luciferase परख की संवेदनशीलता miRNA के जीन की एक बड़ी संख्या को निशाना बनाने का सूक्ष्म प्रभाव का पता लगाने, और जीन नेटवर्क के कई घटकों की पहचान की अनुमति देता है कि एक दिया miRNA के 24 द्वारा विनियमित रहे हैं।
यहाँ हम 3'LIFE प्रोटोकॉल का वर्णन है, और 275 मानव 3'UTRs (चित्रा 1) के एक पैनल के खिलाफ दो अच्छी तरह से विशेषता miRNAs, मीर-10b और जाने-7C स्क्रीनिंग द्वारा यह व्यवहार्यता है प्रदर्शित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
3'LIFE परख उच्च throughput में 3'UTRs में कार्यात्मक miRNA लक्ष्यों की पहचान करता है। यह परख प्रयोगात्मक उनके हित के miRNA के लिए ख्यात लक्ष्यों की एक बड़ी संख्या को पहचानने के लिए जो चाहते हैं शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी ह?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Materials
| Reagents | ||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| ATP | Sigma | FLAAS |
| DTT | Sigma | D0632 |
| MgSO4 | Sigma | M7506 |
| CoA | Sigma | C4282 |
| luciferin | Sigma | L9504 |
| NaCl | Sigma | S7653 |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 |
| BSA | Sigma | A2153 |
| NaN3 | Sigma | S2002 |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| FBS | Sigma | F2442 |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 |
| Trypsin | T2600000 | |
| Consumables | ||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 |
| Instruments | ||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
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