Détection de cibles miARN dans à haut débit utilisant le test de 3'LIFE
Summary
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Abstract
Luminescente identification des éléments fonctionnels dans 3'UTRs (3'LIFE) permet l'identification rapide des objectifs de miARN spécifiques dans un réseau de centaines de 3'UTRs interrogés. identification de la cible est basée sur le dosage à double luciférase, qui détecte la liaison au niveau de l'ARNm par la mesure de sortie en translation, ce qui donne une lecture fonctionnelle de miARN cible. 3'LIFE utilise des tampons non-propriétaires et des réactifs, et des bibliothèques rapporteurs publiquement disponibles, ce qui rend les écrans de l'ensemble du génome faisable et rentable. 3'LIFE peut être effectuée soit dans un laboratoire standard ou mise à l'échelle à l'aide de robots de manipulation de liquides et d'autres instruments à haut débit. Nous illustrons l'approche utilisant un ensemble de données de 3'UTRs humains clonés dans des plaques à 96 puits, et deux miARN de test, laissez-7c et miR-10b. Nous démontrons comment effectuer la préparation de l'ADN, la transfection, la culture cellulaire et des dosages de la luciférase en format à 96 puits, et de fournir des outils pour les donnéesanalyse. En conclusion 3'LIFE est hautement reproductible, rapide et systématique, et identifie des cibles de confiance élevés.
Introduction
L'objectif global de cette méthode est de détecter et cartographier précisément microARN (miARN) cibles à haut débit. MiRNAs sont des ARN endogènes non codantes ~ 22 nucleotides de longueur. Après la transcription et de la transformation, miARN matures sont incorporés dans un complexe protéique appelé l'ARN Induced Silencing Complex (RISC). Chaque miARN guide le RISC pour cibler des éléments situés principalement dans les régions 3 'non traduite (de 3'UTRs) des ARN messagers (ARNm), aboutissant soit à la répression de la traduction ou clivage de l'ARNm 1. MiRNA reconnaître les sites cibles basées sur la norme Watson-Crick et G: U Wobble appariement de bases, et sont dans la nature dégénérée, contenant de multiples paires de bases dépareillés et régions bombé. De nombreux miARN sont largement conservées à partir de plantes pour les humains 2,3, où ils jouent un large éventail de rôles biologiques. Chez les métazoaires miARN peuvent influencer plusieurs processus biologiques, y compris les décisions du destin cellulaire 4, le calendrier de développement 5 </sup>, Et présentent souvent des profils d'expression de tissus spécifiques 6,7. MiRNA misexpression peut également entraîner dans la régulation génique aberrante, qui peut avoir une influence considérable sur le comportement cellulaire basé uniquement sur la fonction des gènes cibles. En tant que tel, les miRNAs sont liés à un large éventail de maladies, y compris la neurodégénérescence 8,9, le diabète et le cancer 10 11. Bioinformatique et des approches humide banc suggèrent que chaque miARN peut être capable de cibler des centaines de milliers d'ARNm distincts 12-14, ce qui indique que de larges approches à haut débit ou du génome sont nécessaires pour sonder cette grande piscine des interactions potentielles.
L'identification de gènes cibles est une composante essentielle de définir mécaniquement fonction miRNA, et pour ce faire les chercheurs doit être en mesure de révéler les cibles sur une grande échelle. Plusieurs approches ont été développées pour identifier des cibles miARN, y compris les algorithmes de prédiction bioinformatique, séquençage à haut débitdes ARNm ciblé et journaliste basé dosages. Chacune de ces approches a ses forces et faiblesses inhérentes. Étant donné que le miRNA ciblage est guidé par une spécificité de séquence, et plus particulièrement de 2 à 6 nucleotides du miARN (appelée la région de la graine), plusieurs algorithmes ont été développés pour prédire des cibles des miRNA dans le génome de plusieurs organismes. Ces algorithmes sont formés en utilisant les motifs observés d'appariement de bases de cibles miARN validées, et utilisent souvent des paramètres tels que l'appariement rigoureux des semences, de la conservation du site, et / ou stabilité thermodynamique 15. Bien que ces filtres affiner le grand nombre de cibles potentielles avec complémentarité suffisante pour objectifs de confiance seulement élevés, ils peuvent exclure les espèces sites cibles miARN spécifiques et non-canoniques, qui sont des preuves récentes suggèrent répandue 16-24. En outre, ces prévisions ne tiennent pas compte des mécanismes de traitement de l'ARNm qui excluent sites cibles miARN, comme polyadénylation alternatif25, édition de l'ARN 26 ARN méthylation 27 et liaison coopérative. En tant que tel, de hauts taux négatifs faux positifs et faux ont été signalés pour de nombreux algorithmes 22,24,28. Bien que ces algorithmes sont utiles pour identifier des cibles miARN candidats pour la validation expérimentale ultérieure, ces taux d'erreur élevés limitent l'efficacité des approches bioinformatiques pour la détection systématique cible miARN.
Pour sonder systématiquement les interactions entre un miRNA donnée et 3'UTRs potentiellement ciblés, nous avons développé un dosage à haut débit appelé luminescent identification des éléments fonctionnels dans 3'UTRs (3'LIFE) 24. Ce dosage des mesures de répression interactions directes et de translation de la 3'UTR de test par une requête miARN utilisant un système rapporteur double luciférase. Dans ce système, la 3 'UTR d'un gène d'intérêt est clone en aval de la luciférase (Fluc) reporter le cadre de lecture luciole. Les inconvénients rapporteurstruct est cotransfecté avec une requête miARN dans les cellules HEK293T. MiRNA ciblage est déterminée en mesurant la variation relative entre la fluc de test :: journaliste 3'UTR et un deuxième non-spécifique de Renilla journaliste. Surtout, les dosages luciférase détectent les interactions miARN / ARNm fonctionnels qui influencent la sortie de translation de la journaliste. Ceci est un avantage clé par rapport aux méthodes traditionnelles pour détecter la réglementation miARN, comme la RT-qPCR et transferts de Western, dans cette contourne différences dans la dégradation de l'ARNm et de la répression de la traduction, ainsi que des changements dans l'abondance des protéines indépendante de régulation fondée 3'UTR.
dosages de la luciférase sont largement utilisés pour valider des cibles miARN directs en raison de leur simplicité et de sensibilité relative, mais leur utilisation dans les écrans à haut débit est limité par les coûts élevés associés à réactifs consommables, le manque de bibliothèques 3'UTR provenant de sources publiques, et l'absence normalisée de luciférase protPROTOCOLES, conduisant à des difficultés en comparant la répression fonctionnelle sur plusieurs jeux de données. Pour faciliter l'utilisation de l'essai de 3'LIFE, nous avons mis l'accent sur la simplification de la conception expérimentale, utilisation de transfection 24 et luciférase réactifs non-commerciaux 29, la création d'une bibliothèque 3'UTR qui est régulièrement mis à jour et élargi, et est disponible à travers un plasmide publique référentiel 30.
L'évolutivité de l'essai de 3'LIFE permet le dépistage d'une grande bibliothèque 3'UTR pour le ciblage par un miARN donné sans solliciter l'écran vers gènes identifiés bioinformatique. En plus de tester les interactions canoniques et prédites, cette approche systématique permet l'identification de nouvelles cibles entraînés par des interactions non-canoniques et / ou espèces spécifiques. Fait important, l'effet de miARN cible sur la production de protéine est généralement comprise dans modeste au résultat de la répression traductionnelle 15,31 </ Sup>, ce qui suggère que le rôle primordial de la réglementation miARN est de peaufiner la production de protéines, protéger contre les niveaux aberrants de l'expression des gènes, et de fournir la robustesse à la cellule des programmes spécifiques 32,33. La sensibilité du dosage de la luciférase combiné avec le intrinsèquement grand nombre d'interactions négatives miARN / ARNm dans l'écran de 3'LIFE permet la détection des effets subtils de miARN cible sur un grand nombre de gènes, et l'identification de plusieurs composants de réseaux de gènes que sont réglementés par un miARN donné 24.
Ici, nous décrivons le protocole de 3'LIFE, et de démontrer qu'il est faisabilité par criblage deux miARN bien caractérisés, miR-10b et laissez-7c contre un panel de 275 3'UTRs humaines (Figure 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Le dosage de 3'LIFE identifie des cibles miARN fonctionnels dans 3'UTRs à haut débit. Ce test est utile pour les chercheurs qui souhaitent identifier expérimentalement un grand nombre de cibles potentielles pour leur miARN d'intérêt. Le dosage de 3'LIFE est une approche puissante pour interroger 3'UTR réglementation entraîné, en ce que le test fournit une mesure fonctionnelle de miARN ciblage, et le test binaire d'un seul journaliste :: 3'UTR contre un seul miARN peuvent aborder en to…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Materials
| Reagents | ||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| ATP | Sigma | FLAAS |
| DTT | Sigma | D0632 |
| MgSO4 | Sigma | M7506 |
| CoA | Sigma | C4282 |
| luciferin | Sigma | L9504 |
| NaCl | Sigma | S7653 |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 |
| BSA | Sigma | A2153 |
| NaN3 | Sigma | S2002 |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| FBS | Sigma | F2442 |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 |
| Trypsin | T2600000 | |
| Consumables | ||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 |
| Instruments | ||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
Referências
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
- Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
- Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
- Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
- Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
- Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
- Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3’UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
- Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to ‘seedless’ 3’UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
- Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
- Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
- Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).
- Chen, J., et al. miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma. Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).
- Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
- Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).
- Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3’LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
- Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3’UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
- Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3’UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204 (2013).
- Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
- Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
- Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).
