检测miRNA靶在高通量的使用3'LIFE分析
Summary
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Abstract
功能元件发光鉴定3'UTRs（3'LIFE）允许数百查询3'UTRs的一个阵列内快速识别特定的miRNA的目标。目标识别是基于双荧光素酶测定法，其检测在mRNA水平通过测量平移输出，给人的miRNA靶向功能的读出绑定。 3'LIFE使用非专用的缓冲液和试剂，并公开提供记者库，使得全基因组屏幕可行和成本效益。 3'LIFE可以执行无论是在标准实验室环境或扩大了使用的液体处理机器人和其他高通量检测仪器。我们示出了使用克隆在96孔板人类3'UTRs和两个测试miRNA的数据集的方法， 让-7C和miR-10b中 。我们展示了如何执行DNA制备，转染，细胞培养和萤光素酶测定在96-孔格式，并提供工具用于数据分析。总之3'LIFE是高度可重复的，快速的，系统的，并确定高可信度的目标。
Introduction
该方法的总体目标是检测并精确地映射微小RNA（miRNA）的目标高通量。 miRNA是内源性非编码RNA〜22个核苷酸长度。以下转录和加工，成熟miRNA在蛋白质复合物掺入称为诱导的沉默复合物（RISC）的RNA。每个miRNA引导RISC靶向主要位于信使RNA的3'非翻译区（3'UTRs）（的mRNA）分子，从而在任一翻译抑制或mRNA切割1。 miRNA的认识到基于标准的Watson-Crick和G靶位点：U摆动碱基配对，并在退化性质，包含多个错配碱基对和凸出的区域。许多miRNA的大致从植物保守到人类2,3，在那里他们发挥生物学作用的多元化。在后生动物miRNA能够影响多个生物过程，包括细胞命运决定4，发育时间5 </sup>，并经常表现出组织特异性表达模式6,7。 miRNA的异常表达也可以导致异常的基因调控，其可以具有关于只对靶基因的功能基于细胞行为实质性影响。这样，微RNA被链接到一个宽范围的疾病，包括神经变性8,9，糖尿病10和癌症11。生物信息学和湿式工作台的方法表明，每个miRNA可以是能够靶向数百至数千不同的mRNA 12-14，表明高通量或全基因组的方法是必需的，以探测该大潜在的相互作用的池。
鉴定的靶基因是机械地限定的miRNA功能的重要组成部分，并且这样做的研究人员必须能够揭示大规模目标。几种方法已经被开发，以确定miRNA靶，包括生物信息学预测算法，高通量测序有针对性的mRNA，并根据记者分析。每一种方法都有固有的长处和短处。给出了miRNA的定位是通过序列特异性的指导下，最显着的核苷酸与miRNA的2-6的（称为点火区），若干算法已经被开发，以在整个许多生物的基因组中预测的miRNA靶。这些算法使用证实的miRNA靶的观察到的碱基配对图案培训，并经常利用的参数，如严格种子配对，现场保护，和/或热力学稳定性15。而这些滤波器缩小大量具有足够互补性的推定的目标，以仅高置信指标，它们可以排除种间特异性和非规范miRNA靶位点，其中最近的证据表明有广泛16-24。此外，这些预测没有考虑到mRNA加工的行为排除miRNA靶位点，如替代多聚腺苷酸账户机制25，RNA编辑26，RNA甲基化27，并协同结合。因此，较高的假阳性和假阴性率已经报道了很多算法22,24,28。虽然这些算法是有用的，以确定用于随后的实验验证候选miRNA靶，这些高错误率限制的生物信息学方法进行系统的miRNA靶标检测的功效。
为了系统地探测和给定的miRNA之间的相互作用可能有针对性3'UTRs我们已经开发了一个名为发光标识功能元素在3'UTRs（3'LIFE）24高通量检测。此测定法测量的直接相互作用，并测试3'UTR的通过使用双荧光素酶报告系统的查询的miRNA翻译抑制。在这个系统中，感兴趣的基因的3'UTR克隆萤火虫荧光素酶（fluc）记者阅读框架的下游。记者利弊truct被共转染在HEK293T细胞中的查询的miRNA。 miRNA的定位是通过测量测试fluc :: 3'UTR记者和一个第二非特异性海肾萤光素酶报道之间的相对变化来确定。重要的是，荧光素酶检测检测影响记者的平移功能输出的miRNA / mRNA的相互作用。这是优于传统方法的关键优势检测miRNA调节，如RT-qPCR的和Western印迹，在这绕过在mRNA降解和翻译抑制的差异，以及在蛋白质丰度的独立的3'UTR基于调节的变化。
萤光素酶测定法被广泛应用，以验证由于其相对简单和灵敏度，但它们在高通量筛选使用直接miRNA靶是通过用消耗品的试剂相关的高费用的限制，缺乏从公共来源3'UTR库，以及没有标准化的荧光素酶PROTocols，导致难以在多个数据集进行比较的功能抑制。为了方便使用3'LIFE分析，我们已经将重点放在了实验设计，利用非商业转24和 荧光素酶试剂29的简化，创造了3'UTR库定期更新和扩展，并且可通过公共质粒库30。
在3'LIFE检测的可扩展性使大3'UTR库筛选而不向偏置确定生物信息学的基因屏幕由给定miRNA的靶。除了测试规范和预测的相互作用，这种系统的方法允许通过非规范和/或物种特异性相互作用驱动的新靶标鉴定。重要的是，miRNA的对蛋白生产靶向的影响一般理解为导致适度翻译抑制15,31 </ SUP>，表明miRNA调节的一个主要作用是微调蛋白输出，防止基因表达的异常水平，并提供鲁棒性与细胞的具体方案32,33。萤光素酶测定法结合固有大量在3'LIFE屏幕负的miRNA / mRNA的相互作用的灵敏度允许检测的miRNA的靶上的大量基因的微妙的影响，和基因网络的多个组件的识别那由给定的miRNA 24进行调节。
在这里，我们描述了3'LIFE协议，并证明它的可行性通过筛选2良好表征的miRNA中，miR-10b和让-7c的对275人的3'UTRs（ 图1）一个面板。
Protocol
Representative Results
Discussion
所述3'LIFE测定标识在高通量3'UTRs官能miRNA靶。此法对研究者谁希望通过实验找出了大量的假定目标他们感兴趣的miRNA的有用。该3'LIFE测定法是有效的方法，以查询3'UTR从动调节，在该测定法提供了一个功能度量的miRNA靶向的，以及一个单一的记者的二进制测试:: 3'UTR针对单一的miRNA可以自信地解决各个基因的靶向状态。为了验证这种方法，我们筛选了275 3'UTRs一个面板和针对两种miRNA?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Materials
| Reagents | ||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| ATP | Sigma | FLAAS |
| DTT | Sigma | D0632 |
| MgSO4 | Sigma | M7506 |
| CoA | Sigma | C4282 |
| luciferin | Sigma | L9504 |
| NaCl | Sigma | S7653 |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 |
| BSA | Sigma | A2153 |
| NaN3 | Sigma | S2002 |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| FBS | Sigma | F2442 |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 |
| Trypsin | T2600000 | |
| Consumables | ||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 |
| Instruments | ||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
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