En hurtig og pålidelig Pipeline for bakteriel Transkriptomet Analyse Case study: Serin-afhængig genregulering i<em> Streptococcus pneumoniae</em
Summary
This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.
Abstract
Genekspression og reguleringen er meget vigtigt at forstå opførslen af celler under forskellige betingelser. Forskellige teknikker anvendes i dag til at studere genekspression, men de fleste er begrænset i forhold til at give et samlet billede af ekspressionen af det hele transkriptomet. DNA microarrays tilbyder en hurtig og økonomisk forskning teknologi, som giver fuldt overblik over global genekspression og har et utal af applikationer, herunder identifikation af nye gener og transkriptionsfaktor bindingssteder, karakterisering af transkriptionsaktivitet af cellerne og også hjælpe med at analysere tusindvis af gener (i et enkelt eksperiment). I den foreliggende undersøgelse, er betingelserne for bakteriel transkriptom analyse fra cellehøst til DNA microarray analyse blevet optimeret. Under hensyntagen til den tid, omkostninger og præcision af forsøgene, denne teknologi platform viser sig at være meget nyttigt og universelt applicabale for at studere bakteriel transcriptomes. Her udfører vi DNA microarray analyse med Streptococcus pneumoniae som case-studie ved at sammenligne de transkriptionelle svarene fra S. pneumoniae dyrket i nærvær af varierende L-serin koncentrationer i mediet. Totalt RNA blev isoleret ved anvendelse af en Macaloid fremgangsmåde under anvendelse af en RNA isolation kit og kvaliteten af RNA blev kontrolleret ved anvendelse af en RNA kvalitetskontrol kit. cDNA blev fremstillet under anvendelse af revers transkriptase og cDNA prøverne blev mærket ved hjælp af en af to aminreaktive fluorescerende farvestoffer. Hjemmelavet Mikromatrice Objektglassene blev anvendt til hybridisering af de mærkede cDNA prøver og microarray data blev analyseret ved hjælp af en ramme cDNA microarray data forbehandling (Microprep). Endelig blev Cyber-T bruges til at analysere de data, der genereres ved hjælp Microprep til identifikation af statistisk signifikante differentielt udtrykte gener. Desuden internt bygget softwarepakker (peber, FIVA, afsløre, anklager, Genome2D) blev anvendt til at analyseredata.
Introduction
Studiet af hele sættet af mRNA overflod (transkriptom) kodet af genomet af en encellet organisme eller en eukaryot celle på et bestemt tidspunkt eller under en specifik tilstand, herunder gen overekspression eller knock-out, kaldes transcriptomics. Transcriptomics tillader os at observere, i hvilket omfang gener udtrykkes under en bestemt tilstand på et tidspunkt X og giver os information om, hvor kraftigt de gener udtrykkes i forhold til en reference.
En mikroarray er en todimensionalt array på et fast substrat (normalt et objektglas eller silicium tyndfilm celle), der kan anvendes til at analysere store mængder af biologisk materiale ved hjælp af high-throughput screening, og miniaturiserede, multiplekset og parallel behandling og påvisning metoder. Microarrays kommer i forskellige typer, herunder DNA-microarrays, protein microarrays, peptid microarrays, væv microarrays, antistof microarrays, cellulære mikroarrays og andre. En DNA microarray erdybest set en samling af mikroskopiske DNA pletter fastgjort til en fast overflade, normalt glas. DNA microarrays anvendes til at måle ekspressionsniveauerne af et gen eller et sæt gener samtidigt eller til genotype flere områder af et genom 2,3. Picomol (10 -12 mol) af en probe er til stede i hver DNA-stedet, der repræsenterer en specifik DNA-sekvens, også kendt som en reporter. De mærkede mRNA molekyler fra prøverne kaldes »maal«. Fluorophorer anvendes til at måle probe-target-hybridisering og påvisning af fluoroforen-mærkede mål bestemmer den relative overflod af nukleinsyresekvenser i målet. En microarray eksperiment kan udrette flere genetiske tests parallelt fordi et array kan indeholde titusinder af prober. Layoutet af en simpel microarray eksperiment er vist i figur 1. For nylig blev det fastslået i vores og andre laboratorier, at disse arrays kan genbruges, hvilket gør denne teknik helt omkostningseffektive virkningsfulde.
Forskellige RNA isolation og rensning teknikker er blevet udviklet gennem årene, herunder C-TAB, SDS og GT metoder 4-8. Endvidere flere kommercielle kits er også tilgængelige. For genekspression høj kvalitet RNA er meget vigtig. Derfor er RNA isoleringsmetoder modificeret til at få en maksimal mængde af RNA. Tilsvarende er trinene til cDNA-fremstilling og mærkning af cDNA minimeres. Normalisering af data efter scanning udføres også effektivt ved hjælp af in-house bygget softwarepakker og værktøjer 9.
Streptococcus pneumoniae er en Gram-positive humane patogen, der koloniserer nasopharynx og er årsag til flere infektioner, såsom lungebetændelse, sepsis, otitis media og meningitis 10. Bakterien kan udnytte en lang række af de næringsstoffer, der kræves for vækst og overlevelse 11,12. Et antal undersøgelser er blevet udført påpneumokok nitrogenmetabolisme og regulering understreger betydningen af aminosyrer og deres rolle i virulens 13,14. I denne undersøgelse transkriptom reaktion S. pneumoniae skiftende koncentrationer af L-serin, en aminosyre rigeligt til stede i humant blodplasma, rapporteres under anvendelse af DNA microarrays. Den transkriptom reaktion S. pneumoniae dyrket i en minimal koncentration af L-serin (150 uM) blev sammenlignet med den dyrkes i en maksimal koncentration (10 mM) af serin. Kemisk defineret medium (CDM eller minimal medium) 15 blev anvendt til denne undersøgelse for at kontrollere koncentrationen af serin. Fokus i denne undersøgelse er at gøre denne teknik brugervenlige og give forskellige værktøjer til data normalisering og analyse. Derfor blev en række værktøjer udviklet til analyse og data fortolkning. FIVA (Funktionel Information Viewer og Analyzer) giver en platform for behandling af oplysninger i klynger af gener medlignende genekspressionsmønstre og til konstruktion af funktionelle profiler 16. Anklager en anden softwarepakke, der gør det lettere at identificere formodede funktioner og anmærkninger af gener 17. Ved at gøre brug af klyngedannelse metoder, beskriver en DNA-bindingssted detektionsalgoritme. Cis reguleringsmyndigheder motiver af gener kan projiceres ved hjælp af denne algoritme 18. Genome2D tilbyder en Windows-baseret platform til visualisering og analyse af transkriptom data ved at tilbyde forskellige farveområder at karakterisere ændringer i genekspression niveauer på et genom kort 19. Peber webserver tilbyder, ud over den alt-i-en analysemetode, en værktøjskasse for minedrift for reguloneme, investorer og transskriptionsfaktorbindingssteder 20. Fuld annotation af intergeniske regioner i et bakteriegenom kan opnås ved hjælp af denne pakke. Biologer kan i høj grad drage fordel af peber, fordi den giver dem en platform for at designe eksperiments så hypotese oplysninger kan bekræftes in vitro 20. Disse softwarepakker bidrage væsentligt til microarray analyse, da de fleste af dem er frit tilgængelige og gøre data normalisering og analyse meget pålidelige.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en brugervenlig protokol, der kan anvendes til at udføre hele transkriptom analyse af bakterier. Det centrale punkt om denne særlige teknik er, at en situation, hvor cellerne høstes vil variere. Efter høst af celler og RNA-isolering, bliver denne teknik ens for alle typer af bakterielle prøver og følger nøjagtigt identiske trin og derfor kan anvendes til enhver type bakteriekultur. Protokollen er meget enkel og praktisk og starter fra RNA-isolering. Vores RNA isolation protokol (ved hjælp af en Maca…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Anne de Jong og Siger Holsappel efter hjælp til DNA mikroarrays slide produktion. Anne de Jong støtte til bioinformatik analyse også værdsat. Vi takker også Jelle Slager for at gennemgå papiret. Muhammad Afzal og Irfan Manzoor understøttes af GC University, Faisalabad, Pakistan under fakultetet udviklingsprogram for HEC Pakistan.
Materials
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
Referências
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
- Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
- Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
- Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
- Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
- Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
- Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
- Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
- Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour’s fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
- Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
- Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495 (2008).
- Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).
- Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).
- De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229 (2012).
- Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery’s virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Molecular Devices, Corp. . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use’s Guide and Tutorial. , (2005).
