צינור מהיר ואמין למחקר בקטריאלי transcriptome ניתוח מקרה: ויסות גני Serine תלויה ב<em> Streptococcus pneumoniae</em
Summary
This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.
Abstract
ביטוי גנים והרגולציה שלה הם מאוד חשובים להבין את התנהגותם של תאים בתנאים שונים. טכניקות שונות משמשות כיום ללמוד ביטוי גנים, אך רובם מוגבלים במונחים של מתן תמונה כוללת של הביטוי לכל transcriptome. מערכי DNA מציעים טכנולוגית מחקר מהירה וכלכלית, אשר נותנת סקירה מלאה של ביטוי גנים הגלובלי ויש להם מספר עצום של יישומים, כולל זיהוי של גנים חדשים וגורם שעתוק מחייבים אתרים, אפיון של פעילות תעתיק של התאים וגם לעזור בניתוח אלפים של גנים (בניסוי יחיד). במחקר הנוכחי, את התנאים לניתוח transcriptome חיידקים מקציר תא לניתוח מערך DNA כבר מותאמים. אם ניקח בחשבון את הזמן, עלויות ודיוק של הניסויים, פלטפורמה טכנולוגית זו מוכיחה להיות שימושי מאוד ואוניברסלי applicabale ללימוד transcripto חיידקיםmes. כאן, אנו מבצעים ניתוח מערך DNA עם pneumoniae Streptococcus כמקרה מבחן-ידי השוואת תגובות תעתיק של ס ' pneumoniae גדל בנוכחות ריכוזים שונים L-סרין במדיום. RNA סה"כ היה מבודד באמצעות שיטת Macaloid באמצעות ערכת בידוד RNA והאיכות של RNA נבדק על ידי שימוש בערכת בדיקת איכות RNA. cDNA הוכן באמצעות transcriptase ההפוך ודגימות cDNA תויגו באמצעות אחת משני צבעי ניאון אמין-reactive. שקופיות מערך DNA תוצרת בית שמשו לכלאה של דגימות cDNA המסומנים ונתונים microarray נותחו באמצעות מסגרת עיבוד מראש נתונים microarray cDNA (Microprep). לבסוף, Cyber-T שימש כדי לנתח את הנתונים שנוצרו באמצעות Microprep לזיהוי גנים הביעו באופן דיפרנציאלי משמעותיים מבחינה סטטיסטית. חבילות תוכנה כמו כן, נבנו בבית (פלפל, FIVA, לחשוף, התובע, Genome2D) שמשו כדי לנתחנתונים.
Introduction
המחקר של המערך השלם של mRNA שפע (transcriptome) מקודד על ידי הגנום של האורגניזם חד-תאי או תא האיקריוטים בזמן מסוים או במצב מסוים, ובכלל זה ביטוי יתר של גן או נוק-אאוט, נקרא transcriptomics. Transcriptomics מאפשר לנו להתבונן למה גני המידה באים לידי ביטוי במצב מסוים בנקודת זמן X ונותן לנו מידע על כמה חזק גנים באים לידי ביטוי ביחס להתייחסות.
Microarray הוא מערך דו-ממדי על מצע מוצק (בדרך כלל שקופיות זכוכית או תא סרט דק סיליקון) שיכול לשמש לassay כמויות גדולות של חומר ביולוגי באמצעות הקרנת תפוקה גבוהה, וממוזער, עיבוד מרובב ומקביל וזיהוי שיטות. Microarrays בא בסוגים שונים, כולל DNA-microarrays, microarrays חלבון, microarrays פפטיד, microarrays רקמות, microarrays נוגדן, microarrays הסלולרי ואחרים. מערך DNA הואבעצם הרכבה של כתמים מיקרוסקופיים DNA קבוע למשטח מוצק, בדרך כלל זכוכית. מערכי DNA משמשים למדידת רמות הביטוי של גן או קבוצת גנים בו זמנית או לגנוטיפ אזורים מרובים של הגנום 2,3. Picomoles (10 -12 שומות) של חללית נמצא בתוך כל מקום DNA שמייצג רצף DNA ספציפי, הידוע גם בכתב. מולקולות mRNA שכותרתו מהדגימות נקראות 'יעדים'. Fluorophores משמשות למדידת הכלאת בדיקה-יעד וזיהוי של מטרות שכותרתו fluorophore קובע את השפע היחסי של רצפי חומצות גרעין ביעד. ניסוי microarray יכול להשיג בדיקות גנטיות מרובות במקביל כי מערך עשוי להכיל עשרות אלפי בדיקות. הפריסה של ניסוי microarray פשוט מוצגת באיור 1. לאחרונה, הוקם במעבדות האחרות שלנו ושהמערכים אלה הם לשימוש חוזר, מה שהופך את עלות effectiv די בטכניקה זודואר.
טכניקות בידוד RNA וטיהור שונות פותחו לאורך השנים כולל C-TAB, SDS ושיטות GT 4-8. יתר על כן, כמה ערכות מסחריות זמינות גם. לביטוי גני RNA באיכות גבוהה הוא חשוב מאוד. לכן, שיטות בידוד RNA הן שונה כדי לקבל כמות המרבית של RNA. באופן דומה, הצעדים להכנת cDNA וסימון של cDNA הם מזעריים. נורמליזציה של נתונים לאחר הסריקה מבוצעת גם ביעילות על ידי שימוש בחבילות תוכנה ב- בית שנבנה וכלים 9.
pneumoniae Streptococcus הוא הפתוגן אנושי גרם-חיובי שcolonizes לוע האף והוא הגורם לזיהומים רבים כגון דלקת ריאות, אלח דם, דלקת אוזן תיכונה ודלקת קרום המוח 10. החיידק יכול לנצל את מגוון רחב של החומרים המזינים הדרושים לצמיחה והישרדות 11,12. מספר המחקרים בוצעו עלחילוף חומרים דלקת ריאות חנקן ורגולציה המדגישים את החשיבות של חומצות אמינו ותפקידם בארסיות 13,14. במחקר זה, תגובת transcriptomic של ס ' pneumoniae לשינוי ריכוזים של L-סרין, חומצת אמינו בשפע קיים בפלזמת הדם האנושית, הוא דיווח באמצעות מערכי DNA. תגובת transcriptomic של ס ' pneumoniae גדל בריכוז מינימאלי של L-סרין (150 מיקרומטר) הושווה שלגדל בריכוז מרבי (10 מ"מ) של סרין. בינוני הגדרה כימית (CDM או בינוני מינימאלי) 15 שימש למחקר זה כדי לשלוט בריכוז של סרין. המוקד של מחקר זה הוא להפוך ידידותי למשתמש בטכניקה זו ולספק כלים שונים לנורמליזציה נתונים וניתוח. לכן, מספר הכלים שפותחו לצורך הניתוח ופרשנות הנתונים. FIVA (מידע Viewer פונקציונלי וAnalyzer) מספק פלטפורמה לעיבוד המידע הכלול באשכולות של גנים שישדפוסים דומים ביטוי גנים ולבניית פרופילים תפקודיים 16. התובע הוא חבילת תוכנה אחרת המאפשרת זיהוי של פונקציות והסברים של גנים 17 משוערים. על ידי עשיית שימוש של שיטות קיבוץ באשכולות, לחשוף מספק אלגוריתם זיהוי אתר הקישור DNA. המוטיבים רגולטורית הסיס של גנים יכולים להיות מוקרנים באמצעות אלגוריתם זה 18. Genome2D מציע פלטפורמה מבוססת Windows להדמיה וניתוח של נתונים transcriptome על ידי הצעת טווחי צבע שונים כדי לאפיין את השינויים ברמות ביטוי גנים על מפת הגנום 19. שרת האינטרנט של הפלפל מציע, בנוסף לשיטת ניתוח all-in-one, ארגז כלים לכרייה לregulons, יזמים וגורם שעתוק מחייב אתרים 20. ביאור מלא של אזורים חוץ-בגנום של חיידקים יכול להיות מושגת על ידי שימוש בחבילה זו. ביולוגים יכולים להפיק תועלת רבה מפלפל כפי שהוא מציע להם במה לעיצוב ניסויs כך שהמידע המשוער ניתן לאשר במבחנה 20. חבילות תוכנה אלה תורמים באופן משמעותי לניתוח microarray כמו רובם זמינים באופן חופשי ולעשות נורמליזציה נתונים וניתוח אמינה מאוד.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים פרוטוקול ידידותי למשתמש שניתן ליישם כדי לבצע ניתוח transcriptome שלם של חיידקים. נקודת המפתח על הטכניקה המסוימת הזה היא שהמצב לפיו התאים נקצרים ישתנה. לאחר קצירת תאי הבידוד ו- RNA, טכניקה זו הופכת להיות שווה לכל סוגי דגימות חיידקים ופועלת בהתאם לשלבים זהים לחלוטין…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים אן דה יונג וSiger Holsappel לעזרה עם הפקת שקופיות מערכי DNA. תמיכתה של אנה דה יונג לניתוח ביואינפורמטיקה גם מוערכת. אנו מודים גם Jelle Slager לבחינת הנייר. מוחמד אפזאל ואירפאן Manzoor נתמך על ידי אוניברסיטת GC, Faisalabad, פקיסטן במסגרת תכנית פיתוח סגל של HEC פקיסטן.
Materials
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
Referências
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
- Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
- Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
- Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
- Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
- Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
- Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
- Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
- Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour’s fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
- Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
- Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495 (2008).
- Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).
- Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).
- De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229 (2012).
- Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery’s virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Molecular Devices, Corp. . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use’s Guide and Tutorial. , (2005).
