En rask og pålitelig Pipeline for Bakteriell transkriptomet Analyse Case: Serine avhengig Gene forordning<em> Streptococcus pneumoniae</em
Summary
This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.
Abstract
Genekspresjon og dens regulering er svært viktig for å forstå oppførselen til cellene under forskjellige forhold. Ulike teknikker brukes i dag til å studere genekspresjon, men de fleste er begrenset i forhold til å gi et helhetlig bilde av uttrykket av hele transkriptomet. DNA-mikromatriser tilby en rask og økonomisk forskning teknologi, som gir full oversikt over global genekspresjon og har et stort antall bruksområder, inkludert identifisering av nye gener og transkripsjonsfaktor bindingsseter, karakterisering av transkripsjonen aktivitet av cellene og også hjelpe i å analysere tusenvis av gener (i et enkelt eksperiment). I denne studien, har vilkårene for bakteriell transkriptom analyse fra celle innhøsting til DNA microarray analyse blitt optimalisert. Tar hensyn til tid, kostnader og nøyaktighet av forsøkene, beviser dette teknologiplattform for å være svært nyttig og universelt applicabale for å studere bakteriell transcriptomes. Her, DNA microarray analyse med Streptococcus pneumoniae som en case-studie vi utfører ved å sammenligne transkripsjons svarene av S. pneumoniae dyrket i nærvær av varierende L-serin konsentrasjoner i mediet. Total RNA ble isolert ved anvendelse av en Macaloid fremgangsmåte ved hjelp av en RNA-isolering kit og kvaliteten av RNA ble kontrollert ved hjelp av en RNA kvalitetskontroll kit. cDNA ble fremstilt ved bruk av revers transkriptase, og de cDNA-prøvene ble merket ved hjelp av en av to amin-reaktivt fluorescerende fargestoffer. Hjemmelaget DNA microarray lysbilder ble brukt for hybridisering av de merkede cDNA prøvene og microarray data ble analysert ved hjelp av en cDNA microarray data pre-prosessering rammeverk (Microprep). Til slutt ble Cyber-T benyttes for å analysere data som genereres ved hjelp av Microprep for identifisering av statistisk signifikante differensielt uttrykte gener. Videre, in-house bygget programvarepakker (pepper, FIVA, avsløre, aktor, Genome2D) ble brukt til å analyseredata.
Introduction
Studiet av hele settet av mRNA overflod (transkriptomet) kodet av genomet til en encellet organisme eller en eukaryot celle på et bestemt tidspunkt eller under en bestemt tilstand, inkludert genet overekspresjon eller knock-out, kalles transcriptomics. Transcriptomics gjør det mulig å observere i hvilken grad gener blir uttrykt under en bestemt tilstand på et tidspunkt X, og gir oss informasjon om hvor sterkt genene er uttrykt i forhold til en referanse.
En mikromatrise er en to-dimensjonal matrise på et fast substrat (vanligvis en glassplate eller silisium tynnfilm celle) som kan brukes til å analysere store mengder av biologisk materiale ved hjelp av high-throughput screening, og miniatyrisert, multiplekset og parallell prosessering og detektering metoder. Mikromatriser kommer i ulike typer, inkludert DNA-mikromatriser, protein mikromatriser, peptid mikromatriser, microarray, antistoff mikromatriser, cellulære mikromatriser og andre. En DNA microarray eri utgangspunktet en sammenstilling av mikroskopiske DNA flekker festet til en fast overflate, vanligvis glass. DNA-mikromatriser blir brukt til å måle ekspresjonsnivåene av et gen eller et sett av gener samtidig eller å genotype flere områder av et genom 2,3. Picomol (10 -12 mol) av en sonde er tilstede i hver DNA-base som representerer en spesifikk DNA-sekvens, også kjent som en reporter. De merkede mRNA molekyler fra prøvene er kalt "mål". Fluoroforer brukes til å måle probe-target-hybridisering og påvisning av fluoroforen-merkede mål bestemmer den relative overflod av nukleinsyresekvenser i målet. Et microarray eksperiment kan utføre flere genetiske tester parallelt fordi en matrise kan inneholde titusenvis av sonder. Utformingen av en enkel mikroarray eksperimentet er vist i figur 1. Nylig ble det fastslått i våre laboratorier og andre at disse matriser er gjenbrukbare, noe som gjør denne teknikken ganske kostnads effective.
Ulike RNA isolering og rensing teknikker har blitt utviklet gjennom årene, inkludert C-TAB, SDS og GT metoder 4 – 8. Videre er det flere kommersielle kits er også tilgjengelig. For genekspresjon av høy kvalitet RNA er meget viktig. Derfor er RNA isoleringsmetoder modifisert for å få en maksimal mengde av RNA. Likeledes er fremgangsmåten for cDNA-preparat og merking av cDNA minimert. Normalisering av data etter skanning er også utført effektivt ved hjelp av in-house bygget programvarepakker og verktøy 9.
Streptococcus pneumoniae er en Gram-positive menneskelige patogen som koloniserer nasopharynx og er årsaken til flere infeksjoner som lungebetennelse, sepsis, mellomørebetennelse og meningitt 10. Bakterien kan anvende en lang rekke av de næringsstoffer som kreves for vekst og overlevelse 11,12. En rekke studier har blitt utført påpneumokokk nitrogen metabolisme og regulering streker viktigheten av aminosyrer og deres rolle i virulens 13,14. I denne studien var transcriptomic respons S. pneumoniae endrede konsentrasjoner av L-serin, en aminosyre rikelig tilstede i menneskeblodplasma, er rapportert ved bruk av DNA-mikromatriser. Den transcriptomic responsen S. pneumoniae dyrket i et minimal konsentrasjon av L-serin (150 pM) ble sammenlignet med den dyrkes i en maksimal konsentrasjon (10 mM) serin. Kjemisk definert medium (CDM eller minimalmedium) 15 ble anvendt for denne studien for å kontrollere konsentrasjonen av serin. Fokus for denne studien er å gjøre denne teknikken brukervennlig og for å gi ulike verktøy for data normalisering og analyse. Det ble derfor utviklet en rekke verktøy for analyse og tolkning av data. FIVA (Funksjonell Informasjon Viewer og Analyzer) gir en plattform for prosessering av informasjon som finnes i klynger av gener medlignende genutrykksmønster og for å konstruere funksjonelle profiler 16. Aktor er en annen programvarepakke som muliggjør identifisering av mulige funksjoner og merknader av gener 17. Ved å gjøre bruk av clustering metoder, beskriver gir et DNA-bindingssted algoritme. Cis-regulatoriske motiver av gener kan projiseres ved hjelp av denne algoritmen 18. Genome2D tilbyr en Windows-basert plattform for visualisering og analyse av transkriptom data ved å tilby ulike fargeområder for å karakterisere endringer i genuttrykk nivåer på et genom kart 19. Pepper webserver tilbyr, i tillegg til alt-i-ett analysemetode, en verktøykasse for gruvedrift for regulons, arrangører og transkripsjon faktor bindingsseter 20. Full annotering av intergeniske regioner i et bakterielt genom kan oppnås ved hjelp av denne pakken. Biologer kan ha stor nytte av pepper som det gir dem en plattform for å designe eksperiments slik at hypotesen informasjonen kan bekreftes in vitro 20. Disse programvarepakker bidra betydelig til microarray analyse som de fleste av dem er fritt tilgjengelig og gjøre data normalisering og analyse svært pålitelig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver et brukervennlig protokoll som kan brukes til å utføre hele transkriptomet analyse av bakterier. Det sentrale poenget om denne teknikken er at tilstanden under hvor cellene høstet vil variere. Etter høsting av celler og RNA-isolering, blir denne teknikken er lik for alle typer av bakterieprøver og følger nøyaktig identiske trinn, og derfor kan anvendes på alle typer bakteriekultur. Protokollen er meget enkel og praktisk og starter fra RNA-isolering. Vår RNA isolering protokollen (med en Macaloid og…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Anne de Jong og Siger Holsappel for hjelp med DNA-mikromatriser lysbilde produksjon. Anne de Jong støtte for bioinformatikk analyse er også verdsatt. Vi takker også Jelle Slager for gjennomgang av papir. Muhammad Afzal og Irfan Manzoor støttes av GC University, Faisalabad, Pakistan under fakultetet utviklingsprogram av HEC Pakistan.
Materials
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
Referências
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
- Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
- Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
- Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
- Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
- Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
- Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
- Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
- Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour’s fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
- Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
- Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495 (2008).
- Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).
- Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).
- De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229 (2012).
- Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery’s virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Molecular Devices, Corp. . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use’s Guide and Tutorial. , (2005).
