Het toepassen van stereotactische injectie techniek om genetische effecten op Animal Gedrag Studie
Summary
Stereotactische injectie van lentivirussen uiten cDNAs of shRNAs kan genexpressie moduleren in specifieke hersengebieden van muizen. Hier presenteren we een protocol om stereotactische injecties te combineren met gedragsproblemen taken, zoals het open veld Test (OFT) en de Gedwongen Swim Test (FST).
Abstract
Stereotactische injectie is een nuttige techniek om hoge titer lentivirussen leveren aan gerichte hersengebieden bij muizen. Lentivirussen kunnen hetzij overexpressie of knockdown genexpressie in een relatief geconcentreerde gebied zonder significante schade aan het hersenweefsel. Na het herstel, kan de geïnjecteerde muis worden getest op verschillende behavioral taken, zoals het open veld Test (OFT) en de Gedwongen Swim Test (FST). De OFT is ontworpen om de voortbeweging en de angstige fenotype bij muizen beoordelen door het meten van de hoeveelheid tijd die een muis doorbrengt in het midden van een nieuw open veld. Een angstig muis aanzienlijk minder tijd in het midden van het nieuwe veld in vergelijking met controles. De FST beoordeelt de anti-depressieve fenotype door het kwantificeren van de hoeveelheid tijd die de muizen onbeweeglijk doorbrengen indien opgelost in een emmer water. Een muis met een anti-depressieve fenotype zal aanzienlijk minder tijd immobiel vergelijking met controledieren brengen. Het doel van dit protocol is om de ster te gebruikeneotactic injectie van een lentivirus in combinatie met gedrags-tests om te beoordelen hoe genetische factoren moduleren dierlijk gedrag.
Introduction
De muis is op grote schaal gebruikt in neurobiologie omdat het gemakkelijk genetisch te manipuleren. Gene knockout technieken kunnen de onderzoekers te onderzoeken hoe elke genetische factor vormen muis gedrag. Bovendien is het cre-loxP systeem een waardevol instrument voor weefsel- en cel type- specifiek gen knockout muizen, die onderzoekers in staat stelt bestudering van genfunctie in verschillende weefsels. 1 In de praktijk, expressiepatronen van cre promoters zijn moeilijk te beheersen , en tot nu toe veel gevestigde cre stuurprogramma's zijn niet regio-specifieke expressie bereikt. 2,3
Alternatief stereotactische injectie is een methode die specifieke hersengebieden van de volwassen muis gericht. Door het injecteren van genetisch gemanipuleerde virussen die cDNA of shRNA kan regiospecifieke modulering van genexpressie bereikt. Hoewel de omvang van de hersenen van elke muis varieert, kan de locatie van specifieke hersengebieden worden bepaald met behulp van stereotactische coördinatienates ingesteld van oriëntatiepunten op de schedel van de hersenen van muizen. De meest gebruikte monumenten zijn bregma, lambda, en de interaurale lijn. Met coördinaten verkregen uit een hersenatlas kan 4 de exacte locatie van elk hersengebied worden geïdentificeerd door de antero-posterior (A / P), mediaal-lateraal (M / L) en dorsale-ventrale (D / V) as van bregma / interaurale lijn kruising. Typisch Virussen geïnjecteerd in de hersenen van muizen gelabeld met ofwel rood of groen fluorescent eiwit (RFP en GFP), waardoor injecties kan worden bevestigd door fluorescentie microscopie.
Behavioral evaluaties van muizen zijn vooral nodig voor fundamenteel onderzoek van psychiatrische stoornissen. Symptomen van psychiatrische stoornissen bij patiënten betrekken meestal abnormaal gedrag. Sommige van deze menselijke gedragingen evolutionair geconserveerd en kan direct worden nagebootst en waargenomen in de muis. Bijvoorbeeld kan depressie worden gemodelleerd in de muis door meting behavioral wanhoop. Mensen met een depressie often het gevoel alsof ze niets doen zal ooit helpen, een symptoom dat uiteindelijk kan leiden tot zelfmoord. Bij knaagdieren, kan deze worden gemodelleerd met behulp van de temperatuur zwemtest (FST), die de hoeveelheid tijd die een muis zwemmen versus drijvend in een plas water (gezien vanaf opgeven) meet. Dit paradigma is gevalideerd door het redden van het fenotype met anti-depressiva. 7,8,9 Muizen die anti-depressiva hebben ontvangen zal aanzienlijk minder tijd immobiel te besteden in vergelijking met onbehandelde controles. Een andere gedragstest, het Open Gebied Test (OFT) is ontworpen om voortbeweging beoordelen muizen, en bovendien kan worden gebruikt om de angstige fenotype bij muizen geanalyseerd. 5,6 Deze test is gebaseerd op de vooronderstelling dat muizen zich veiliger ze dichtbij aan de wand in een nieuw open veld. Wild-type muizen zal uiteindelijk verkennen van de nieuwe omgeving, zoals ze zijn nieuwsgierige dieren. Echter, minder tijd in het midden van het veld geeft angst bij de muis, omdat de muis niet in staat om de initia overwinnenl angst veroorzaakt door een nieuwe omgeving. De angst van de muis, zoals gekwantificeerd door de hoeveelheid tijd doorgebracht in het centrum van een open veld, vergelijkbaar met de klinische angst bij mensen, die in vele psychiatrische stoornissen.
De combinatie van stereotactische injecties van gedragsparadigma's is een nieuwe manier om doelgericht hersengebied de expressie van een specifiek gen te wijzigen. Het effect van gemoduleerde genexpressie op muis gedrag kan dan worden bepaald. In tegenstelling tot volledige hersenen knockout Deze werkwijze is bijzonder nuttig omdat het alleen gericht specifieke hersengebieden. Daarnaast worden stereotactische injecties typisch uitgevoerd in de volwassen wildtype muis derhalve endogene genexpressie wordt gehandhaafd gedurende ontwikkelingsstadia. Deze methode zal het verwarren effect te vermijden als het gen vereist is voor overleving tijdens de embryonale en postnatale ontwikkelingsstadium. Een belangrijke beperking is dat de experimentele muizen moeten throug gaanh een invasieve chirurgie, waarbij de schedels van muizen te openen. Bovendien wordt de mate van modulatie gen bepaald door de titer en de efficiëntie van het virus. Het virus moet worden geïnjecteerd in de juiste regio middels stereotactische coördinaten, waarbij speciale instrumenten vereist. Controle van de juiste injectieplaats kan alleen worden voltooid post mortem.
Deze werkwijze is eerder gebruikt om de betrokkenheid van een specifiek gen in verschillende neurologische aandoeningen testen. Virale gemedieerde RNAi gericht op het Th-gen (waardoor dopamine te synthetiseren) werd geïnjecteerd in de substantia nigra compacta en locomotorische gedragsanalyse uitgevoerd. 10 Een andere studie gebruikte stereotactische injectie van een lentivirus silencing DISC1 te muisgedrag dan worden geëvalueerd schizofrenie. Knockdown van DISC1 geleid tot meer beweging in reactie op de nieuwigheid (parallellen positieve symptomen bij schizofrenie), en een grotere onbeweeglijkheid in deFST. 11 Evenzo is de aanvullende studie bleek dat 5-HT1B overexpressie geleid tot meer verkenningsgedrag in het OFT, in overeenstemming met een anti-angst fenotype met deze methode. 12 Stereotactische injecties cre virus leveren recombinatie induceren in cre-loxP muizen . Deze methode werd gebruikt om de Y2 receptor in de amygdala en de bed kern van de stria terminalis één verwijderen. Bij gedragsanalyse, werden deze muizen blijkt een antidepressieve fenotype wanneer het gen in de centrale amygdala is verwijderd, maar geen fenotype wanneer het gen in de basolaterale amygdala of bed kern van de stria terminalis is verwijderd. 13 Aldus is deze techniek verschaft een uniek instrument om de genetische invloed op dierlijke gedrag bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Succesvolle stereotactische injecties afhankelijk van drie factoren: het houden van de muis in leven, het instellen van het juiste nulpunt voor coördinaten (tip van de naald op de kruising van bregma en de interaurale lijn), en het instellen van de juiste diepte aan het nulpunt (tip van de naald alleen aanraken van de buitenzijde van het hersenweefsel). De levensvatbaarheid van de muizen belang. Chirurgie overleving kan worden geholpen door ervoor te zorgen dat de muis goed is verdoofd en krijgt voldoende pijnstillende…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereotactic Apparatus item 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Quintessential stereotaxic pump | Stoelting co. | 53311 | |
| Injection Styringe, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| PEI | Polysciences Inc. | 23966 | |
| Scissors | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| Blunt end forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Needle holder | Fine Surgical Tools | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Microtorque control box, Tech2000 handpiece | with pedal |
| Glass bead sterilizer | Inotech | IS-400 | |
| Absorbable sutures | Unify | M-K518r19 | Absorbable, reverse cutting |
| Cotton swabs | VWR | 89031-270 | |
| Heating pad | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Artificial tears | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Disposable syringe | BD Syringe | 309623 | |
| Cloth | |||
| Gloves | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin or other anesthetic | see recipe citation | ||
| Ketoprofen or other analgesic | see veternarian | ||
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| Tracking Camera | Noldus | Media Recorder |
Referências
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).
- Hirrlinger, J., et al. Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo. PLoS One. 4 (1), 1-10 (2009).
- Fenno, L. E., et al. Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic. Nature Protocols. 11 (7), 763-772 (2014).
- Paxinos, G., Franklin, K. . The mouse brain in sterotaxic coordinates. , (2001).
- Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. Mood and anxiety related phenotypes in mice: the open field test. Humana Press. 42, 1-20 (2009).
- Denenberg, V. H. Open-field behavior in the rat: W.0hat does it mean. Annals of the New York Academy of Sciences. 159, 852-859 (1969).
- Bogdanova, O. V., Kanekar, S., D’Anci, K. E., Renshaw, P. F. Factors influencing behavior in the forced swim test. Physiology & Behavior. 118, 227-239 (2013).
- Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. Behavioral despair in rats: A new model sensitive to antidepressant treatments. European Journal of Pharmacology. 47 (4), 379-391 (1978).
- Hunsberger, J., Dunman, C. Animal models for depression-like and anxiety-like behavior. Nature Protocol Exchange. , (2007).
- Hommel, J. D., Sears, R. M., Georgescu, D., Simmons, D. L., DiLeone, R. J. Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference. Nature Medicine. 9 (12), 1539-1544 (2003).
- Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136 (6), 1017-1031 (2009).
- Clark, M. S., Sexton, T. J., McClain, M., Root, D., Kohen, R., Neumai, J. F. Overexpression of 5-HT1B receptor in dorsal raphe nucleus using herpes simplex virus gene transfer, increases anxiety behavior after inescapable stress. Journal of Neuroscience. 2 (11), 4550-4562 (2002).
- Tasan, R. O., et al. The central and basolateral amygdala are critical sites of neuropeptide Y/Y2 receptor-mediated regulation of anxiety and depression. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6282-6290 (2010).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protoc Hum Gen. 12 (12.10), (2007).
- Carter, D. A. Anesthetizing mice. Methods Mol Biol. 18, 135-136 (1993).
- Alachkar, A., Jiang, D., Harrison, M., Zhou, Y., Chen, G., Mao, Y. An EJC factor RBM8a regulates anxiety behaviors. Current Molecular Medicine. 13 (6), 887-899 (2013).
- Bernal, J., Baldwin, M., Gleason, T., Kuhlman, S., Moore, G., Talcott, M. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery. 22, 445-451 (2009).
- Wahlsten, D. Getting ready for testing. Mouse Behavioral Testing: How to use mice in behavioral neuroscience. Academic Press. , 133-141 (2011).
- Kheirbek, M. A., et al. Differential control of learning and anxiety along the dorso-ventral axis of the dentate gyrus. Neuron. 6 (77), 955-968 (2013).
- Snyder, J. S., Soumier, A., Brewer, M., Pickel, J., Cameron, H. A. Adult hippocampal neurogenesis buffers stress responses and depressive behaviors. Nature. 476 (7361), 458-461 (2011).
- Sik-Lee, J., et al. Induction of neuronal vascular endothelial growth factor expression by cAMP in the dentate gyrus of the hippocampus is required for antidepressant-like behaviors. Journal of Neuroscience. 29 (26), 8493-8505 (2009).
- Miller, D. G., Adam, M. A., Miller, A. D. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection. Molecular and Cellular Biology. 10 (8), 4239-4242 (1990).
- Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).
