Application Technique d'injection stéréotaxique pour étudier les effets génétiques sur les comportements des animaux
Summary
Injection stéréotaxique de lentivirus exprimant les ADNc ou shRNA peuvent moduler l'expression génique dans des zones spécifiques du cerveau de souris. Ici, nous présentons un protocole de combiner injections stéréotaxiques avec des tâches comportementales, comme le test Open Field (OFT) et le test de natation forcée (FST).
Abstract
Injection stéréotaxique est une technique utile pour fournir des lentivirus de titre élevé dans les zones ciblées du cerveau chez la souris. Les lentivirus peuvent soit surexpression ou l'expression des gènes knockdown dans une région relativement concentré, sans dommages importants aux tissus du cerveau. Après la récupération, la souris injectée peut être testée sur différentes tâches comportementales telles que le test Open Field (OFT) et le test de natation forcée (FST). L'OFT est conçu pour évaluer la locomotion et le phénotype anxieux chez la souris par la mesure de la quantité de temps que d'une souris passe au centre d'un roman plein champ. Une souris plus anxieux va passer beaucoup moins de temps dans le centre du champ roman par rapport aux témoins. La FST évalue le phénotype anti-dépressif en quantifiant la quantité de temps que les souris passent immobile lorsqu'il est placé dans un seau d'eau. Une souris avec un phénotype anti-dépressive va passer beaucoup moins de temps immobile par rapport aux animaux témoins. L'objectif de ce protocole est d'utiliser le stereotactic injection d'un lentivirus en conjonction avec des tests comportementaux pour évaluer comment les facteurs génétiques moduler les comportements animaux.
Introduction
La souris a été largement utilisé en neurobiologie, car il est facile à manipuler génétiquement. Techniques Gene knock-out permettent aux chercheurs d'étudier comment chaque facteur génétique façonne les comportements de souris. En outre, le système cre-loxP fournit un outil précieux pour tissulaire et la cellule type- KO de gène spécifique chez la souris, ce qui permet aux chercheurs d'étudier la fonction des gènes dans différents tissus. 1 Toutefois, dans la pratique, les profils d'expression des promoteurs de la CRE sont difficiles à contrôler , et si loin de nombreux chauffeurs de cre établies ont pas atteint l'expression spécifique à la région. 2,3
En variante, une injection stéréotaxique est une méthode qui cible des régions spécifiques du cerveau de la souris adulte. Par l'injection de virus génétiquement modifiés exprimant des shRNA ou ADNc, de la modulation de l'expression génique spécifique à la région peut être obtenue. Bien que la taille du cerveau de chaque souris varie, l'emplacement des régions spécifiques du cerveau peut être déterminé en utilisant coor stéréotaxiquenates réglée de points de repère sur le crâne du cerveau de la souris. Les monuments les plus couramment utilisés sont bregma, lambda, et la ligne interauriculaire. Utilisation de coordonnées obtenues à partir d'un atlas du cerveau, 4 l'emplacement exact de chaque région du cerveau peut être identifié par le antéro-postérieur (A / P), médiale-latérale (M / L), et dorso-ventral (D / V) des axes à partir de bregma / interaural intersection de la ligne. Typiquement les virus se injecté dans le cerveau de souris sont étiquetés avec soit la protéine fluorescente rouge ou vert (DP ou GFP), de sorte que les injections peuvent être confirmés par la microscopie à fluorescence.
Évaluations comportementales de souris sont particulièrement nécessaires pour la recherche fondamentale de troubles psychiatriques. Les symptômes de troubles psychiatriques chez les patients impliquent généralement des comportements anormaux. Certains de ces comportements humains sont évolutivement conservées et peuvent être directement imité et observé chez la souris. Par exemple, la dépression peut être modélisée chez la souris par la mesure de désespoir comportemental. Les gens souffrant de dépression OFTen se sentent comme si de rien ils ne seront jamais aider, un symptôme qui peut éventuellement conduire au suicide. Chez les rongeurs, ce qui peut être modélisée en utilisant le test de natation forcée (FST), qui mesure la quantité de temps par rapport à une souris de natation flottant dans une piscine d'eau (considéré comme l'abandon). Ce paradigme est validée par le sauvetage du phénotype avec des anti-dépresseurs. 7,8,9 souris qui ont reçu des anti-dépresseurs vont passer beaucoup moins de temps immobile par rapport à des témoins non traités. Un autre test comportemental, le test Open Field (OFT) est conçu pour évaluer la locomotion chez la souris, et peut en outre être utilisé pour analyser le phénotype anxieux chez la souris. 5,6 Ce test est basé sur la prémisse que les souris se sentent plus en sécurité quand ils sont proches au mur dans un roman plein champ. Souris de type sauvage finiront explorer le nouvel environnement, car ils sont des animaux curieux. Cependant, passer moins de temps dans le centre du champ indique l'anxiété chez la souris, que la souris ne sera pas en mesure de surmonter l'initial la peur provoquée par un nouvel environnement. L'angoisse de la souris, telle que quantifiée par la quantité de temps passé dans le centre d'un champ ouvert, peut être comparé à l'anxiété clinique chez l'homme, qui est présent dans de nombreux troubles psychiatriques.
La combinaison des injections stéréotaxiques de paradigmes comportementaux est une nouvelle façon de modifier l'expression d'un gène spécifique dans une zone ciblée du cerveau. L'effet de l'expression du gène modulé sur les comportements de la souris peut alors être déterminée. Contrairement à élimination directe de l'ensemble du cerveau, cette méthode est particulièrement utile, car elle ne vise que les zones spécifiques du cerveau. En outre, des injections stéréotaxiques sont généralement effectuées chez l'adulte de souris de type sauvage, par conséquent, l'expression du gène endogène a été maintenue tout au long des stades de développement. Cette méthode permet d'éviter l'effet de confondre si le gène est nécessaire pour la survie pendant le stade embryonnaire ou post-natale de développement. Une limitation majeure est que les souris expérimentales doivent aller through une chirurgie invasive, dont les crânes de souris doivent être ouvert. En outre, le degré de modulation de gène est déterminée par l'efficacité et le titre du virus. Le virus doit être injecté dans la région correcte en utilisant les coordonnées stéréotaxiques, qui exige des instruments spéciaux. Vérification du site d'injection correct ne peut être achevé post-mortem.
Cette méthode a été précédemment utilisé pour tester l'implication d'un gène spécifique dans diverses maladies neurologiques. Par exemple, virale ARNi médiée par ciblage du gène Th (qui permet la dopamine à synthétiser) a été injecté dans la compacta substance noire, et l'analyse du comportement locomoteur a été effectuée. 10 Une autre étude a utilisé injection stéréotaxique d'un silençage DISC1 lentivirus pour évaluer le comportement de la souris en ce qui concerne de la schizophrénie. Knockdown de DISC1 entraîné une augmentation de la locomotion en réponse à la nouveauté (parallèles symptômes positifs de la schizophrénie), et une plus grande immobilité dans leFST. 11 De même, une étude complémentaire a révélé que 5-HT 1B surexpression conduit à un comportement exploratoire augmenté dans l'OFT, compatible avec un phénotype anti-anxiété en utilisant cette méthode. 12 injections stéréotaxiques peuvent livrer virus de la CRE pour induire la recombinaison chez les souris cre-loxP . Cette méthode a été utilisée pour supprimer de manière sélective le récepteur Y2 dans l'amygdale et le noyau du lit de la strie terminale. Lors de l'analyse du comportement, ces souris ont été trouvés à un phénotype anti-dépressif lorsque le gène a été supprimée dans l'amygdale centrale, mais aucun phénotype lorsque le gène a été supprimée dans l'amygdale basolatérale ou le noyau du lit de la strie terminale. 13 Ainsi, cette technique fournit un outil unique d'étudier l'effet génétique sur les comportements des animaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Injections stéréotaxiques succès reposent sur trois facteurs: en gardant la souris vivante, le réglage du point zéro correct pour coordonnées (pointe de l'aiguille sur l'intersection de bregma et la ligne interauriculaire), et le réglage de la bonne profondeur au point zéro (pointe de l'aiguille juste toucher l'extérieur du tissu cérébral). La viabilité des souris est important. la survie de la chirurgie peut être facilitée en faisant en sorte que la souris est correctement anesthésié et …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereotactic Apparatus item 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Quintessential stereotaxic pump | Stoelting co. | 53311 | |
| Injection Styringe, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| PEI | Polysciences Inc. | 23966 | |
| Scissors | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| Blunt end forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Needle holder | Fine Surgical Tools | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Microtorque control box, Tech2000 handpiece | with pedal |
| Glass bead sterilizer | Inotech | IS-400 | |
| Absorbable sutures | Unify | M-K518r19 | Absorbable, reverse cutting |
| Cotton swabs | VWR | 89031-270 | |
| Heating pad | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Artificial tears | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Disposable syringe | BD Syringe | 309623 | |
| Cloth | |||
| Gloves | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin or other anesthetic | see recipe citation | ||
| Ketoprofen or other analgesic | see veternarian | ||
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| Tracking Camera | Noldus | Media Recorder |
Referências
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