Injecção estereotáxica de lentivírus expressando cDNAs ou shRNAs pode modular a expressão de genes em áreas específicas do cérebro de ratos. Aqui, apresentamos um protocolo para combinar injeções estereotáxica com tarefas comportamentais, como o campo aberto Test (OFT) eo Teste de Natação Forçada (FST).
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Artigo de método
Aplicando a técnica de injecção estereotáxica para estudar os efeitos genéticos sobre os comportamentos animais
Neste artigo
Resumo
Resumo
Injecção estereotáxica é uma técnica útil para entregar lentivírus de título elevado para as áreas do cérebro em ratos segmentados. Os lentivírus podem ou sobre-expressar ou a expressão do gene knockdown numa região centrada relativamente sem danos significativos para o tecido do cérebro. Após a recuperação, o rato injetado pode ser testado em várias tarefas comportamentais, tais como o campo aberto Test (OFT) eo Teste de Natação Forçada (FST). O OFT é concebido para avaliar o fenótipo locomoção e ansioso em ratos, medindo a quantidade de tempo que um rato passa no centro de um novo campo aberto. Um rato mais ansiosos vai gastar muito menos tempo no centro do romance campo em comparação aos controles. O FST avalia o fenótipo anti-depressivo por quantificação da quantidade de tempo que os ratos passam imóvel quando colocada num balde de água. Um rato com um fenótipo anti-depressivo vai gastar muito menos tempo imóvel comparado ao grupo controle. O objetivo deste protocolo é usar o stereotactic injeção de um lentivírus em conjunto com testes comportamentais para avaliar como fatores genéticos modular comportamentos animais.
Introdução
O rato tem sido amplamente utilizada em neurobiologia, porque é fácil de manipular geneticamente. Técnicas gene knockout permitir que os investigadores para investigar como cada fator genético molda comportamentos do mouse. Além disso, o sistema cre-loxP fornece uma ferramenta valiosa para Tecido e célula de tipo nocaute de genes específicos em camundongos, o que permite aos pesquisadores para estudar a função de genes em diferentes tecidos. 1 Contudo, na prática, os padrões de promotores cre de expressão são difíceis de controlar , e até agora muitos condutores cre estabelecidas não ter alcançado uma expressão específica da região 2,3.
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Protocolo
NOTA: Todos os protocolos que envolvam animais foram seguidos de acordo com as orientações de cuidados de animais de The Pennsylvania State University, IACUC # 44057
1. Lentivírus Produção
NOTA: O dia antes da transfecção, LentiX-293 deve ser a 80% de confluência.
- Lavar as células com DMEM apenas antes da transfecção e incubar em 10 ml de DMEM / 10% de FBS com penicilina (100 UI / ml) e estreptomicina (100 ug / ml) durante 5 min à TA.
- Dilui-se o ADN e polietilenimina (PEI) (1 mg / ml) em 1: 3 de proporção (1 ug de ADN: 3 ul de PEI) em 1 ml de DMEM e vortex durante 1 min. O volume de ADN ad....
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Resultados
Injeção estereotáxica precisas depende fortemente de definir as coordenadas corretas. A ponta da agulha utilizada para injectar o vírus deve ser definido directamente na intersecção da bregma e a linha interaural (Figura 1). É útil a utilização de um microscópio estereoscópico para determinar se ou não a agulha está correctamente colocado. Ao olhar através do microscópio, a agulha deve ser posicionado de modo que, se o vírus foram injectados, seria aterrar directamente na intersecção da bregma e a.......
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Discussão
Injecções estereotáxicas de sucesso dependem de três fatores: manter o rato vivo, definindo o ponto zero correto para coordenadas (ponta da agulha na intersecção de bregma ea linha interaural), e definir a profundidade direito ao ponto zero (ponta da agulha apenas a tocar o exterior do tecido cerebral). A viabilidade dos murganhos é importante. Sobrevivência cirurgia pode ser auxiliada por certificando-se de que o mouse está devidamente anestesiados e recebe analgésica adequada. A dor é conhecido por ser uma das princip.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado em parte pelo American Heart Association Scientist Development Grant e NARSAD Young Investigator Award para Yingwei Mao.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Aparelho estereotáxico item 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Bomba estereotáxica por excelência | Stoelting co. | 53311 | |
| Injeção de Estiringa, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| PEI | Policiências Inc. | 23966 | |
| Tesouras | Ferramentas Cirúrgicas Finas | 14084-08 | |
| Pinças de extremidade romba | Ferramentas Cirúrgicas Finas | 11002-12 | |
| Porta-agulhas | Fine Surgical Tools | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Caixa de controle de microtorque, peça de mão Tech2000 | com pedal |
| Esterilizador de esferas de vidro | Inotech | IS-400 | |
| Unify | M-K518r19 | Absorvível, corte reverso | |
| Cotonetes | VWR | 89031-270 | |
| Almofada de aquecimento | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Lágrimas artificiais | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Seringa | descartável BD Seringa | 309623 | |
| Luvas de pano | |||
| & nbsp; | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin ou outro anestésico | veja citação | ||
| Cetoprofeno ou outro analgésico | veja veternário | ||
| Software de rastreamento | Noldus | Ethovision XT | |
| Câmera de rastreamento | Noldus | Media Recorder |
Referências
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).
- Hirrlinger, J., et al.
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Reimpressões e permissões
