स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन तकनीक को लागू पशु व्यवहार पर आनुवंशिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए
Summary
Lentiviruses cDNAs व्यक्त या shRNAs चूहों के विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में जीन की अभिव्यक्ति न्यूनाधिक कर सकते हैं की स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन। यहाँ, हम इस तरह के खुले मैदान टेस्ट (ओ एफ टी) और मजबूर तैरो टेस्ट (एफ एस) के रूप में व्यवहार कार्यों, साथ स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन गठबंधन करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
Abstract
स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन चूहों में लक्षित मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए उच्च अनुमापांक lentiviruses वितरित करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है। Lentiviruses overexpress या मस्तिष्क के ऊतकों के लिए महत्वपूर्ण नुकसान के बिना एक अपेक्षाकृत ध्यान केंद्रित क्षेत्र में पछाड़ना जीन की अभिव्यक्ति कर सकते हैं या तो। वसूली के बाद, इंजेक्ट माउस ऐसे ओपन फील्ड परीक्षण (ओ एफ टी) और मजबूर तैरो टेस्ट (एफ एस) के रूप में विभिन्न व्यवहार कार्यों पर परीक्षण किया जा सकता है। बहुधा एक माउस एक उपन्यास खुले मैदान के मध्य में खर्च करता है कि समय की मात्रा को मापने के द्वारा चूहों में हरकत और चिंतित फेनोटाइप का आकलन करने के लिए बनाया गया है। एक और अधिक उत्सुक माउस नियंत्रण की तुलना में उपन्यास मैदान के मध्य में काफी कम समय बिताना होगा। एफ एस टी पानी की एक बाल्टी में रखा जब चूहों स्थिर खर्च उस समय की राशि बढ़ाता द्वारा विरोधी अवसादग्रस्तता फेनोटाइप का आकलन है। एक विरोधी अवसादग्रस्तता phenotype के साथ एक माउस जानवरों नियंत्रण की तुलना में काफी कम समय स्थिर खर्च करेगा। इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य ster उपयोग करने के लिए हैव्यवहार परीक्षण के साथ संयोजन के रूप में एक lentivirus के eotactic इंजेक्शन पशु व्यवहार मिलाना कैसे आनुवंशिक कारकों का आकलन करने के लिए।
Introduction
यह आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के लिए आसान है क्योंकि माउस व्यापक रूप से तंत्रिका जीव विज्ञान में इस्तेमाल किया गया है। जीन पीटा तकनीक प्रत्येक आनुवंशिक कारक माउस व्यवहार को आकार कैसे शोधकर्ताओं ने जांच करने के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, रचनात्मक-loxP प्रणाली ऊतक के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है और विभिन्न ऊतकों में जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है शोधकर्ताओं जो चूहों में type- विशिष्ट जीन पीटा, सेल। 1 हालाँकि, व्यवहार में, रचनात्मक प्रमोटरों की अभिव्यक्ति पैटर्न पर नियंत्रण करने के लिए मुश्किल हो जाता है , और अब तक कई स्थापित रचनात्मक चालकों क्षेत्र विशेष अभिव्यक्ति हासिल नहीं किया है। 2,3
वैकल्पिक रूप से, स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन वयस्क माउस के विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करता है कि एक विधि है। सीडीएनए या shRNA व्यक्त अनुवांशिक इंजीनियर वायरस को इंजेक्शन लगाने के द्वारा, जीन अभिव्यक्ति के क्षेत्र विशेष मॉडुलन प्राप्त किया जा सकता है। प्रत्येक माउस के मस्तिष्क के आकार बदलता रहता है, विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों के स्थान स्टीरियोटैक्टिक coordi का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता हैनितंब माउस मस्तिष्क की खोपड़ी पर स्थलों से निर्धारित किया है। सबसे अधिक इस्तेमाल किया स्थलों पर्वबिन्दु, लैम्ब्डा, और interaural लाइन कर रहे हैं। एक मस्तिष्क एटलस से प्राप्त निर्देशांक का उपयोग करना, प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र के 4 सटीक स्थान Antero-पीछे (ए / पी), औसत दर्जे का पार्श्व (एम / एल) से पहचाना जा सकता है, और पृष्ठीय उदर (डी / वी) से कुल्हाड़ियों पर्वबिन्दु / interaural लाइन चौराहे। इंजेक्शन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की जा सकती है, ताकि आम तौर पर चूहों के दिमाग में इंजेक्शन वायरस, या तो लाल या हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी या GFP) के साथ टैग कर रहे हैं।
चूहों के व्यवहार के मूल्यांकन मानसिक विकारों के बुनियादी अनुसंधान के लिए विशेष रूप से आवश्यक हैं। रोगियों में मानसिक बीमारियों के लक्षण आम तौर पर असामान्य व्यवहार शामिल है। इन मानव व्यवहार के कुछ evolutionarily संरक्षित कर रहे हैं और सीधे मजाक उड़ाया और माउस में मनाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अवसाद व्यवहार निराशा को मापने के द्वारा माउस में मॉडलिंग की जा सकती है। बार बार अवसाद के साथ लोगवे कभी भी मदद मिलेगी करते कुछ भी नहीं है के रूप में हालांकि एन, अंत में आत्महत्या करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि एक लक्षण महसूस हो रहा है। कृन्तकों में, इस पानी का एक पूल में तैर बनाम तैराकी एक माउस (ऊपर देने के रूप में देखा) समय की राशि है जो उपाय जबरिया तैरो टेस्ट (एफ एस टी) का उपयोग करते हुए मॉडलिंग की जा सकती है। इस प्रतिमान विरोधी अवसाद के साथ phenotype के बचाव के द्वारा मान्य है। अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में काफी कम समय स्थिर खर्च करेगा अवसाद विरोधी प्राप्त हुआ है जो 7,8,9 चूहों। एक और व्यवहार परीक्षण खुले मैदान टेस्ट (ओ एफ टी) चूहों में हरकत का आकलन करने के लिए बनाया गया है, और इसके साथ ही चूहों में उत्सुक फेनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 5,6 इस परीक्षा में वे बंद कर रहे हैं, जब चूहों को सुरक्षित महसूस करते हैं कि इस तथ्य पर आधारित है एक उपन्यास खुले मैदान में दीवार के लिए। वे उत्सुक जानवर हैं के रूप में जंगली प्रकार चूहों अंततः, उपन्यास वातावरण का पता लगाने जाएगा। हालांकि, क्षेत्र के केंद्र में कम समय खर्च माउस पहल पर काबू पाने में सक्षम नहीं होगा, के रूप में माउस में चिंता इंगित करता हैएल डर एक उपन्यास पर्यावरण के द्वारा लाया। एक खुले मैदान के मध्य में बिताए समय की राशि द्वारा मात्रा के रूप में माउस की चिंता, कई मानसिक विकारों में मौजूद है जो मानव में नैदानिक चिंता, की तुलना में किया जा सकता है।
व्यवहार मानदंड के साथ स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन के संयोजन एक लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र में एक विशेष जीन की अभिव्यक्ति को बदलने के लिए एक उपन्यास तरीका है। माउस व्यवहार पर संग्राहक जीन की अभिव्यक्ति के प्रभाव को फिर से निर्धारित किया जा सकता है। पूरे दिमाग पीटकर के विपरीत, इस विधि यह केवल विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों लक्ष्य के रूप में विशेष रूप से उपयोगी है। इसके अलावा, स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन आम तौर पर वयस्क जंगली प्रकार माउस में प्रदर्शन कर रहे हैं, इसलिए, अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति विकास के चरणों भर में बनाए रखा गया है। जीन के विकास का भ्रूण या प्रसव के बाद के चरण के दौरान अस्तित्व के लिए आवश्यक है, तो इस विधि को उलझाना प्रभाव से बचना होगा। एक प्रमुख सीमा प्रयोगात्मक चूहों throug के लिए जाने की जरूरत है किएच चूहों की खोपड़ी है, जिसमें एक इनवेसिव सर्जरी, खोला जाएगा। इसके अलावा, जीन मॉडुलन की डिग्री वायरस की अनुमापांक और दक्षता से निर्धारित होता है। वायरस विशेष उपकरणों की आवश्यकता है जो स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक का उपयोग कर सही क्षेत्र, में इंजेक्शन की जरूरत है। सही इंजेक्शन साइट का सत्यापन ही पोस्टमार्टम पूरा किया जा सकता है।
इस विधि में पहले विभिन्न मस्तिष्क संबंधी बीमारियों में एक विशेष जीन की भागीदारी का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण के लिए, वायरल मध्यस्थता आरएनएआई (डोपामाइन संश्लेषित किया जा करने के लिए अनुमति देता है) गु जीन को लक्षित सब्सटैंशिया निग्रा कॉम्पेक्टा में इंजेक्ट किया गया था, और हरकत व्यवहार विश्लेषण का आयोजन किया गया था। 10 अन्य अध्ययन के संबंध में माउस व्यवहार का आकलन करने के लिए एक lentivirus के मुंह बंद DISC1 की स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन का इस्तेमाल किया एक प्रकार का पागलपन के लिए। DISC1 की पछाड़ना नवीनता के जवाब में वृद्धि हुई हरकत के लिए एलईडी (समानताएं एक प्रकार का पागलपन में सकारात्मक लक्षण), और अधिक से अधिक गतिहीनताएफ एस टी। 11 इसी तरह, एक अतिरिक्त अध्ययन 5 हिंदुस्तान टाइम्स 1 बी overexpression, बहुधा में वृद्धि हुई खोजपूर्ण व्यवहार करने के लिए इस विधि का उपयोग कर एक विरोधी चिंता phenotype के साथ संगत है कि नेतृत्व मिला। 12 स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन रचनात्मक-loxP चूहों में पुनर्संयोजन प्रेरित करने के लिए रचनात्मक वायरस वितरित कर सकते हैं । इस विधि चुनिंदा प्रमस्तिष्कखंड में Y2 रिसेप्टर और हलकी लीक terminalis के बिस्तर नाभिक को हटाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। व्यवहार विश्लेषण करने पर, इन चूहों जीन केंद्रीय प्रमस्तिष्कखंड में हटा दिया गया था जब एक विरोधी अवसादग्रस्तता phenotype के लिए पाया गया है, लेकिन जीन basolateral प्रमस्तिष्कखंड या हलकी लीक terminalis के बिस्तर नाभिक में हटा दिया गया था जब कोई फेनोटाइप। 13 इस प्रकार, इस तकनीक पशु व्यवहार पर आनुवंशिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक अनूठे उपकरण प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सफल स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन तीन कारकों पर निर्भर करते हैं: सुई की (टिप, जिंदा माउस रखने (पर्वबिन्दु के चौराहे और interaural लाइन पर सुई की नोक) निर्देशांक के लिए सही शून्य बिंदु की स्थापना, और शून्य बात करने क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereotactic Apparatus item 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Quintessential stereotaxic pump | Stoelting co. | 53311 | |
| Injection Styringe, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| PEI | Polysciences Inc. | 23966 | |
| Scissors | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| Blunt end forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Needle holder | Fine Surgical Tools | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Microtorque control box, Tech2000 handpiece | with pedal |
| Glass bead sterilizer | Inotech | IS-400 | |
| Absorbable sutures | Unify | M-K518r19 | Absorbable, reverse cutting |
| Cotton swabs | VWR | 89031-270 | |
| Heating pad | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Artificial tears | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Disposable syringe | BD Syringe | 309623 | |
| Cloth | |||
| Gloves | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin or other anesthetic | see recipe citation | ||
| Ketoprofen or other analgesic | see veternarian | ||
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| Tracking Camera | Noldus | Media Recorder |
Referências
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