Påføring Stereotactic injeksjonsteknikk å studere genetiske effekter på dyreadferd
Summary
Stereotactic injeksjon av lentiviruses uttrykke cDNAs eller shRNAs kan modulere genuttrykk i bestemte hjerneområder mus. Her presenterer vi en protokoll for å kombinere stereotaktiske injeksjoner med atferds oppgaver, for eksempel Open Feltet Test (OFT) og Tvunget Swim Test (FST).
Abstract
Stereotaktisk injeksjon er en nyttig teknikk for å levere høy titer lentiviruses til målrettede hjerneområder hos mus. Lentiviruses kan enten overuttrykker eller knockdown genekspresjon i et relativt fokusert område uten vesentlig skade på hjernevevet. Etter utvinning, kan den injiserte mus testes på ulike atferdsmessige oppgaver som det åpne feltet Test (OFT) og Tvunget Swim Test (FST). Den ofte er konstruert for å vurdere bevegelse og engstelig fenotypen hos mus ved å måle hvor lang tid som en mus tilbringer i sentrum av en ny åpne feltet. En mer engstelig mus vil bruke betydelig mindre tid i sentrum av romanen feltet sammenlignet med kontroller. FST vurderer den anti-depressive fenotype ved å kvantifisere mengden av tid som mus tilbringer immobile når den er plassert i en bøtte med vann. En mus med en anti-depressiv fenotype vil bruke betydelig mindre tid immobile i forhold til kontrolldyrene. Målet med denne protokollen er å bruke stereotactic injeksjon av et lentivirus i forbindelse med atferdstester for å vurdere hvordan genetiske faktorer modulere dyreatferd.
Introduction
Musen har vært mye brukt i neurobiology fordi det er lett å manipulere genetisk. Gene knockout teknikker tillate forskere å undersøke hvordan hver genetisk faktor former muse atferd. Videre gir cre-loxP-systemet et verdifullt verktøy for vevs- og celletypespesifikke gen i knockout mus, noe som gjør det mulig for forskere å undersøke genfunksjon i forskjellige vev. 1. Men i praksis, ekspresjonsmønster av Cre promotorer er vanskelige å kontrollere og så langt mange etablerte Cre-driverne er ikke oppnådd regionspesifikk uttrykk. 2,3
Alternativt er stereotaktisk injeksjon en metode som er rettet mot bestemte områder av hjernen til den voksne mus. Ved å injisere genetisk modifiserte virus som uttrykker cDNA eller shRNA, kan oppnås regionspesifikke modulering av genekspresjon. Selv om hjerne størrelsen på hver mus varierer, kan plasseringen av bestemte områder av hjernen bestemmes ved anvendelse av stereotaktisk koordineringNates satt fra landemerker på skallen av musen hjernen. De mest brukte landemerker er bregma, lambda, og interaural linje. Ved hjelp av koordinater hentet fra en hjerne atlas, kan 4 den nøyaktige plasseringen av hver hjerneområdet identifiseres av Antero-posterior (A / P), medial-lateral (M / L), og dorsal-ventral (D / V) økser fra bregma / interaural linje krysset. Vanligvis virus injisert inn i hjernen til mus er merket med enten rødt eller grønt fluorescerende protein (RFP eller GFP), slik at injeksjoner kan bekreftes av fluorescerende mikroskopi.
Behavioral vurderinger av mus er spesielt nødvendig for grunnleggende forskning av psykiatriske lidelser. Symptomer på psykiatriske lidelser hos pasienter vanligvis involverer unormal atferd. Noen av disse menneskelige atferd er evolusjonært konservert og kan være direkte etterlignet og observert hos mus. For eksempel kan depresjon være modellert i musen ved å måle atferdsfortvilelse. Mennesker med depresjon often føler som om ingenting de gjør noen gang vil hjelpe, et symptom som til slutt kan føre til selvmord. I gnagere, kan dette være modellert med Forced Swim Test (FST), som måler hvor lang tid en mus svømming versus flytende i et basseng med vann (sett på som å gi opp). Dette paradigmet er validert av redde fenotype med anti-depressiva. 7,8,9 Mus som har fått antidepressiva vil bruke betydelig mindre tid immobile sammenlignet med ubehandlede kontroller. En annen adferdstest, det åpne feltet Test (OFT) er utviklet for å vurdere locomotion i mus, og i tillegg kan brukes til å analysere engstelig fenotype hos mus. 5,6 Denne testen er basert på premisset om at musene føler seg tryggere når de er nær til veggen i en roman åpent felt. Villtype mus vil til slutt utforske det nye miljøet som de er nysgjerrige dyr. Imidlertid tilbringer mindre tid i midten av det felt indikerer angst hos mus, som mus ikke vil være i stand til å overvinne innledetl frykt brakt videre av en roman miljø. Angsten av musen, som kvantifiseres ved hvor mye tid tilbrakt i sentrum av et åpent felt, kan sammenlignes med klinisk angst hos mennesker, som er til stede i mange psykiatriske lidelser.
Kombinasjonen av stereotaktisk injeksjon med atferds paradigmer er en ny måte å endre ekspresjonen av et spesifikt gen i et målrettet hjerneområde. Effekten av modulert genekspresjon på mus oppførsel kan deretter bestemmes. I motsetning til hele hjernen knockout Denne metode er spesielt nyttig da det bare er rettet mot spesifikke hjerneområder. I tillegg er stereotaktisk injeksjon typisk utført i voksen villtype mus derfor endogene gen-ekspresjon har blitt opprettholdt gjennom hele utviklingsstadier. Denne metoden vil unngå forvirre virkning hvis genet er nødvendig for å overleve under embryonisk eller postnatal utviklingstrinn. En viktig begrensning er at de eksperimentelle mus trenger å gå through en invasiv kirurgi, der skallen på mus må åpnes. Dessuten er graden av genet modulering bestemt av titer og effektiviteten av viruset. Viruset må injiseres inn i det riktige området ved hjelp av stereotaktisk koordinater, noe som krever spesielle instrumenter. Verifikasjon av riktig injeksjonsstedet kan bare gjennomføres post mortem.
Denne fremgangsmåte er tidligere blitt brukt til å teste involvering av et bestemt gen i forskjellige neurologiske sykdommer. For eksempel, virale mediert RNAi rettet mot Th-genet (som lar dopamin som syntetiserte) ble injisert i substantia nigra compacta og bevegelsesatferd analyse ble utført. 10 En annen studie benyttet stereotaktisk injeksjon av et lentivirus lyddemping DISC1 å vurdere mus atferd i forhold til schizofreni. Knockdown av DISC1 ført til økt bevegelse i respons til nyhet (paralleller positive symptomer ved schizofreni), og større immobilitet iFST. 11 Tilsvarende ytterligere studie fant at 5-HT 1B overekspresjon ført til økt utforskende atferd i OFT, i samsvar med en anti-angst fenotype ved hjelp av denne metoden. 12 Stereo injeksjoner kan levere cre virus å indusere rekombinasjon i CRE-loxP mus . Denne metoden ble benyttet for selektivt å slette Y2-reseptoren i mandelen og sengen kjernen av stria termin. Ved adferdsanalysen, ble disse musene syntes et anti-depressive fenotype når genet ble slettet i den sentrale amygdala, men ingen fenotype når genet ble fjernet i basolaterale amygdala eller sengen kjernen av stria termin. 13 Således, denne teknikken gir et unikt verktøy for å studere den genetiske effekt på dyreatferd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vellykket stereotaktiske injeksjoner stole på tre faktorer: å holde musen i live, sette riktig nullpunktet for koordinatene (nålespissen på skjæringspunktet mellom bregma og interaural line), og sette riktig dybde til nullpunktet (tuppen av nålen bare berøre utsiden av hjernevev). Levedyktigheten til mus er viktig. Kirurgi overlevelse kan bli hjulpet ved å sørge for at musen er skikkelig bedøvet og får tilstrekkelig smertestillende. Smerte er kjent for å være en viktig årsak til dårlig restitusjon etter o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereotactic Apparatus item 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Quintessential stereotaxic pump | Stoelting co. | 53311 | |
| Injection Styringe, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| PEI | Polysciences Inc. | 23966 | |
| Scissors | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| Blunt end forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Needle holder | Fine Surgical Tools | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Microtorque control box, Tech2000 handpiece | with pedal |
| Glass bead sterilizer | Inotech | IS-400 | |
| Absorbable sutures | Unify | M-K518r19 | Absorbable, reverse cutting |
| Cotton swabs | VWR | 89031-270 | |
| Heating pad | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Artificial tears | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Disposable syringe | BD Syringe | 309623 | |
| Cloth | |||
| Gloves | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin or other anesthetic | see recipe citation | ||
| Ketoprofen or other analgesic | see veternarian | ||
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| Tracking Camera | Noldus | Media Recorder |
Referências
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).
- Hirrlinger, J., et al. Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo. PLoS One. 4 (1), 1-10 (2009).
- Fenno, L. E., et al. Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic. Nature Protocols. 11 (7), 763-772 (2014).
- Paxinos, G., Franklin, K. . The mouse brain in sterotaxic coordinates. , (2001).
- Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. Mood and anxiety related phenotypes in mice: the open field test. Humana Press. 42, 1-20 (2009).
- Denenberg, V. H. Open-field behavior in the rat: W.0hat does it mean. Annals of the New York Academy of Sciences. 159, 852-859 (1969).
- Bogdanova, O. V., Kanekar, S., D’Anci, K. E., Renshaw, P. F. Factors influencing behavior in the forced swim test. Physiology & Behavior. 118, 227-239 (2013).
- Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. Behavioral despair in rats: A new model sensitive to antidepressant treatments. European Journal of Pharmacology. 47 (4), 379-391 (1978).
- Hunsberger, J., Dunman, C. Animal models for depression-like and anxiety-like behavior. Nature Protocol Exchange. , (2007).
- Hommel, J. D., Sears, R. M., Georgescu, D., Simmons, D. L., DiLeone, R. J. Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference. Nature Medicine. 9 (12), 1539-1544 (2003).
- Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136 (6), 1017-1031 (2009).
- Clark, M. S., Sexton, T. J., McClain, M., Root, D., Kohen, R., Neumai, J. F. Overexpression of 5-HT1B receptor in dorsal raphe nucleus using herpes simplex virus gene transfer, increases anxiety behavior after inescapable stress. Journal of Neuroscience. 2 (11), 4550-4562 (2002).
- Tasan, R. O., et al. The central and basolateral amygdala are critical sites of neuropeptide Y/Y2 receptor-mediated regulation of anxiety and depression. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6282-6290 (2010).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protoc Hum Gen. 12 (12.10), (2007).
- Carter, D. A. Anesthetizing mice. Methods Mol Biol. 18, 135-136 (1993).
- Alachkar, A., Jiang, D., Harrison, M., Zhou, Y., Chen, G., Mao, Y. An EJC factor RBM8a regulates anxiety behaviors. Current Molecular Medicine. 13 (6), 887-899 (2013).
- Bernal, J., Baldwin, M., Gleason, T., Kuhlman, S., Moore, G., Talcott, M. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery. 22, 445-451 (2009).
- Wahlsten, D. Getting ready for testing. Mouse Behavioral Testing: How to use mice in behavioral neuroscience. Academic Press. , 133-141 (2011).
- Kheirbek, M. A., et al. Differential control of learning and anxiety along the dorso-ventral axis of the dentate gyrus. Neuron. 6 (77), 955-968 (2013).
- Snyder, J. S., Soumier, A., Brewer, M., Pickel, J., Cameron, H. A. Adult hippocampal neurogenesis buffers stress responses and depressive behaviors. Nature. 476 (7361), 458-461 (2011).
- Sik-Lee, J., et al. Induction of neuronal vascular endothelial growth factor expression by cAMP in the dentate gyrus of the hippocampus is required for antidepressant-like behaviors. Journal of Neuroscience. 29 (26), 8493-8505 (2009).
- Miller, D. G., Adam, M. A., Miller, A. D. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection. Molecular and Cellular Biology. 10 (8), 4239-4242 (1990).
- Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).
