Aplicando a técnica de injecção estereotáxica para estudar os efeitos genéticos sobre os comportamentos animais
Summary
Injecção estereotáxica de lentivírus expressando cDNAs ou shRNAs pode modular a expressão de genes em áreas específicas do cérebro de ratos. Aqui, apresentamos um protocolo para combinar injeções estereotáxica com tarefas comportamentais, como o campo aberto Test (OFT) eo Teste de Natação Forçada (FST).
Abstract
Injecção estereotáxica é uma técnica útil para entregar lentivírus de título elevado para as áreas do cérebro em ratos segmentados. Os lentivírus podem ou sobre-expressar ou a expressão do gene knockdown numa região centrada relativamente sem danos significativos para o tecido do cérebro. Após a recuperação, o rato injetado pode ser testado em várias tarefas comportamentais, tais como o campo aberto Test (OFT) eo Teste de Natação Forçada (FST). O OFT é concebido para avaliar o fenótipo locomoção e ansioso em ratos, medindo a quantidade de tempo que um rato passa no centro de um novo campo aberto. Um rato mais ansiosos vai gastar muito menos tempo no centro do romance campo em comparação aos controles. O FST avalia o fenótipo anti-depressivo por quantificação da quantidade de tempo que os ratos passam imóvel quando colocada num balde de água. Um rato com um fenótipo anti-depressivo vai gastar muito menos tempo imóvel comparado ao grupo controle. O objetivo deste protocolo é usar o stereotactic injeção de um lentivírus em conjunto com testes comportamentais para avaliar como fatores genéticos modular comportamentos animais.
Introduction
O rato tem sido amplamente utilizada em neurobiologia, porque é fácil de manipular geneticamente. Técnicas gene knockout permitir que os investigadores para investigar como cada fator genético molda comportamentos do mouse. Além disso, o sistema cre-loxP fornece uma ferramenta valiosa para Tecido e célula de tipo nocaute de genes específicos em camundongos, o que permite aos pesquisadores para estudar a função de genes em diferentes tecidos. 1 Contudo, na prática, os padrões de promotores cre de expressão são difíceis de controlar , e até agora muitos condutores cre estabelecidas não ter alcançado uma expressão específica da região 2,3.
Em alternativa, a injecção estereotáxica é um método que tem como alvo regiões específicas do cérebro de rato adulto o. Por injecção de vírus geneticamente modificadas que expressam ADNc ou shRNA, a modulação da expressão génica específica da região pode ser alcançado. Embora o tamanho do cérebro de cada ratinho varia, a localização de regiões específicas do cérebro pode ser determinada utilizando coor estereotáxicanates definir a partir de pontos de referência no crânio do cérebro do rato. Os marcos mais comumente usados são bregma, lambda, ea linha interaural. Utilizando as coordenadas obtidas a partir de um atlas cerebrais, 4 a localização exacta de cada área do cérebro pode ser identificado pela ântero-posterior (A / P), medial-lateral (H / L), e dorso-ventral (D / V) de eixos bregma / intersecção linha interaural. Tipicamente os vírus injectado no cérebro de ratos são marcados com qualquer proteína fluorescente vermelha ou verde (GFP ou RFP), de modo que as injecções pode ser confirmada por microscopia de fluorescência.
Avaliações comportamentais dos ratos são especialmente necessários para a investigação básica de transtornos psiquiátricos. Os sintomas de transtornos psiquiátricos em pacientes tipicamente envolvem comportamentos anormais. Alguns destes comportamentos humanos são evolutivamente conservada e pode ser directamente imitou e observadas no rato. Por exemplo, a depressão pode ser modelada no rato medindo desespero comportamental. Pessoas com depressão often sentir como se nada fazem sempre vai ajudar, um sintoma que pode eventualmente levar ao suicídio. Em roedores, este pode ser modelado utilizando o Teste de Natação Forçada (FST), que mede a quantidade de tempo que um rato nadando contra flutuando em uma piscina de água (vistos como desistir). Este paradigma é validada por resgatar o fenótipo com anti-depressivos. 7,8,9 ratos que receberam anti-depressivos vai gastar muito menos tempo imóvel comparação com os controlos não tratados. Outro teste comportamental, o teste de campo aberto (OFT) é concebido para avaliar a locomoção em ratinhos, e, adicionalmente, pode ser utilizada para analisar o fenótipo ansiedade em ratos. 5,6 Este teste baseia-se na premissa de que os ratos se sentir mais segura quando estão perto para a parede em um romance campo aberto. Camundongos selvagens acabará por explorar o novo ambiente, pois são animais curiosos. No entanto, passar menos tempo no centro do campo indica ansiedade no rato, como o rato não irá ser capaz de superar a INITIAl medo causado por um ambiente de romance. A ansiedade do rato, como quantificado pela quantidade de tempo despendido no centro de um campo aberto, pode ser comparada a ansiedade clínica em seres humanos, o qual está presente em muitos distúrbios psiquiátricos.
A combinação de injecções estereotáxicas com os paradigmas comportamentais é uma nova maneira de alterar a expressão de um gene específico em uma área alvo do cérebro. O efeito da expressão do gene modulado em comportamentos de ratos pode então ser determinada. Em contraste com nocaute do cérebro inteiro, este método é particularmente útil uma vez que tem como alvo apenas áreas específicas do cérebro. Além disso, as injecções estereotáxicas são tipicamente realizadas no tipo selvagem do rato adulto, por conseguinte, a expressão do gene endógeno foi mantida ao longo das etapas de desenvolvimento. Este método vai evitar o efeito confundem, se o gene é necessária para a sobrevivência durante o estágio embrionário ou pós-natal do desenvolvimento. Uma grande limitação é que os camundongos experimentais precisa ir through uma cirurgia invasiva, em que os crânios dos murganhos têm de ser abertos. Além disso, o grau de modulação do gene é determinada por titulação e a eficiência do vírus. O vírus tem de ser injectado na região correcta através de coordenadas estereotáxicas, que requer instrumentos especiais. Verificação do local de injecção correcta só pode ser concluído post mortem.
Este método tem sido utilizado para testar o envolvimento de um gene específico em várias doenças neurológicas. Por exemplo, viral mediada por ARNi do gene alvo Th (que permite a dopamina a ser sintetizado) foi injectada na substância negra compacta, e a análise do comportamento locomotor foi conduzido. 10 Outro estudo utilizou injecção estereotáxica de um Disc1 silenciamento lentivírus para avaliar o comportamento do rato em relação a esquizofrenia. Knockdown de Disc1 levaram a um aumento da locomoção em resposta a novidade (paralelos sintomas positivos em esquizofrenia), e maior na imobilidadeFST. 11 De forma semelhante, um estudo adicional descobriu que 5-HT 1B superexpressão levou a um comportamento exploratório aumentado no OFT, consistente com um fenótipo anti-ansiedade usando este método. 12 injecções estereotáxicas pode entregar vírus para induzir a recombinação cre em ratinhos cre-loxP . Este método foi utilizado para eliminar selectivamente o receptor Y2 na amígdala e o núcleo da estria terminal. Após a análise comportamental, estes ratos foram encontrados para um fenótipo anti-depressivo quando o gene foi eliminado na amígdala central, mas não fenótipo quando o gene foi eliminado na amígdala basolateral ou do núcleo do leito do stria terminalis. 13 Assim, esta técnica fornece uma ferramenta única para estudar o efeito genético sobre os comportamentos dos animais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Injecções estereotáxicas de sucesso dependem de três fatores: manter o rato vivo, definindo o ponto zero correto para coordenadas (ponta da agulha na intersecção de bregma ea linha interaural), e definir a profundidade direito ao ponto zero (ponta da agulha apenas a tocar o exterior do tecido cerebral). A viabilidade dos murganhos é importante. Sobrevivência cirurgia pode ser auxiliada por certificando-se de que o mouse está devidamente anestesiados e recebe analgésica adequada. A dor é conhecido por ser uma …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereotactic Apparatus item 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Quintessential stereotaxic pump | Stoelting co. | 53311 | |
| Injection Styringe, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| PEI | Polysciences Inc. | 23966 | |
| Scissors | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| Blunt end forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Needle holder | Fine Surgical Tools | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Microtorque control box, Tech2000 handpiece | with pedal |
| Glass bead sterilizer | Inotech | IS-400 | |
| Absorbable sutures | Unify | M-K518r19 | Absorbable, reverse cutting |
| Cotton swabs | VWR | 89031-270 | |
| Heating pad | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Artificial tears | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Disposable syringe | BD Syringe | 309623 | |
| Cloth | |||
| Gloves | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin or other anesthetic | see recipe citation | ||
| Ketoprofen or other analgesic | see veternarian | ||
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| Tracking Camera | Noldus | Media Recorder |
Referências
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