Применяя Стереотаксическая техника инъекций по изучению генетических эффектов на животных Поведения
Summary
Стереотаксической инъекции лентивирусы выражения кДНК или shRNAs может модулировать экспрессию генов в определенных областях головного мозга мышей. Здесь мы приводим протокол для объединения стереотаксические инъекции с поведенческими задач, таких как тест открытого поля (УДК) и принудительного плавания Test (ФСТ).
Abstract
Стереотаксической инъекции полезный метод, чтобы доставить высокий титр лентивирусы целевых областей мозга у мышей. Лентивирусов можете гиперэкспрессией или нокдаун экспрессии генов в относительно целенаправленного области без значительного ущерба для ткани головного мозга. После выздоровления, вводят мыши могут быть проверены на различных поведенческих задач, таких как тест открытого поля (УДК) и принудительного плавания Test (ФСТ). УДК предназначен для оценки движения и тревожный фенотип у мышей путем измерения количества времени, которое тратит мыши в центре нового открытом поле. Более тревожно мыши провести значительно меньше времени в центре нового поля по сравнению с контролем. ФСТ оценивает анти-депрессивный фенотип путем количественного определения количества времени, что мыши, провести неподвижными, когда помещается в ведре воды. Мышь с анти-депрессивной фенотипа будет тратить значительно меньше времени неподвижности по сравнению с контрольными животными. Цель этого протокола заключается в использовании СТЕРЕОeotactic инъекции лентивирусом в сочетании с поведенческие тесты, чтобы оценить, как генетические факторы, модулировать поведение животных.
Introduction
Мышь была широко используется в области нейробиологии, потому что это легко манипулировать генетически. Методы генной нокаутом позволит исследователям изучить, как каждый генетический фактор формирует поведение мыши. Кроме того, CRE-LoxP система обеспечивает ценный инструмент для ткане и клеточной специфической для данного типа гена нокаут у мышей, который позволяет исследователям изучать функцию генов в различных тканях. 1 Тем не менее, на практике, выражение закономерности CRE промоутеров трудно контроля , и до сих пор многие известные драйверы CRE не достигли выражение для конкретного региона. 2,3
Кроме того, стереотаксической инъекции метод, который нацелен на определенные регионы мозга взрослой мыши. Вводя генетически вирусы, экспрессирующие кДНК или shRNA, конкретного региона модуляции экспрессии гена может быть достигнуто. Хотя размер мозг каждой мыши изменяется, расположение конкретных областей мозга может быть определена с использованием стереотаксической коорнат установить с достопримечательностями на черепе головного мозга мыши. Наиболее часто используемые ориентиры брегма, лямбда, и Interaural линии. Использование координаты, полученные от головного мозга атласа, 4 точное местоположение каждой области мозга можно определить по передне-задней (/ P), медиального-боковой (M / L), и спинной-вентральной (Д / В) осей от брегма / Interaural линии пересечения. Обычно вирусы вводили в мозге мышей с тегами или красным или зеленым флуоресцентным белком (GFP или RFP), так что инъекции могут быть подтверждены с помощью флуоресцентной микроскопии.
Поведенческие оценки мышей особенно необходимы для фундаментальных исследований психических расстройств. Симптомы психических расстройств у пациентов, как правило, связаны аномальное поведение. Некоторые из этих поведения человека эволюционно консервативными и могут быть непосредственно подражал и наблюдается у мышей. Например, депрессия может быть смоделирована в мыши путем измерения поведения отчаяние. Люди с депрессией OFTан чувствовать, как будто ничего не делают никогда помочь, а симптом, который может в конечном счете привести к самоубийству. У грызунов, это может быть смоделирована с помощью принудительного плавания Test (ФСТ), который измеряет количество времени, мышь плавание против плавающей в бассейне с водой (рассматривается как отказ от). Это парадигма подтверждено спасение фенотип с антидепрессантов. 7,8,9 мышей, которые получили антидепрессанты будут тратить значительно меньше времени неподвижно по сравнению с необработанными управления. Другой поведенческий тест, тест открытом поле (УДК) предназначен для оценки передвижения у мышей, и дополнительно может быть использован для анализа тревожный фенотип у мышей. 5,6 Этот тест основан на предпосылке, что мыши чувствуют себя безопаснее, когда они близки к стене в романе открытом поле. Мышей дикого типа, в конечном счете изучить новой среде, так как они любопытные животные. Тем не менее, тратить меньше времени в центре поля указывает тревогу у мышей, а мыши не смогут преодолеть Первол страх, вызванный новой среде. Беспокойство мыши, а количественно по количеству времени, проведенного в центре открытом поле, можно сравнить с клинической тревоги у человека, который присутствует во многих психических расстройств.
Сочетание стереотаксических инъекций с поведенческими парадигмами является новым способом изменения экспрессии конкретного гена в целевой области мозга. Эффект экспрессии гена модулированного на поведение мыши могут быть определены. В отличие от всей нокаутом мозга, этот метод особенно полезен, поскольку он только цели конкретных областей мозга. Кроме того, стереотаксических инъекции, как правило, выполняется в взрослых мышей дикого типа, следовательно, выражение эндогенный ген был сохранен на протяжении стадий развития. Этот метод позволит избежать посрамить силу, если ген необходим для выживания во время эмбрионального или послеродовой стадии развития. Одним из основных ограничений является то, что экспериментальные мыши нужно идти через вч инвазивной хирургии, в котором черепа мышей должны быть открыты. Кроме того, степень генной модуляции определяется титром и эффективностью вируса. Вирус должен быть введен в правильном регионе, используя стереотаксические координаты, которая требует специальных инструментов. Проверка правильной месте инъекции может быть завершена только посмертно.
Этот метод был ранее использован для тестирования участия конкретного гена в различных неврологических заболеваний. Например, вирусные РНК-интерференции опосредовано ориентации гена Th (дофамина, который позволяет быть синтезированы) вводили в черной субстанции компактов и анализа поведения опорно-двигательного аппарата проводилось. 10 Другое исследование используется стереотаксической инъекции в лентивирусов глушителей DISC1 оценить поведение мыши по отношению шизофрении. Нокдаун DISC1 привели к увеличению передвижения в ответ на новизну (параллели положительные симптомы шизофрении), и больше неподвижность вФСТ. 11 Точно так же, дополнительные исследования обнаружили, что 5-НТ 1В экспрессия привело к увеличению исследовательского поведения в OFT, в соответствии с анти-тревога фенотипа с использованием этого метода. 12 Стереотаксические инъекции могут доставить вирус CRE, чтобы побудить рекомбинации в CRE-LoxP мышей , Этот метод был использован для селективного удаления рецептор Y2 в миндалине и постельное ядро терминальной полоски. При поведенческого анализа, эти мыши были обнаружены анти-депрессивной фенотипа, когда ген был удален в центральной миндалине, но не фенотип, когда ген был удален в базолатеральной миндалине или кровати ядра терминальной полоски. 13 Таким образом, этот метод обеспечивает уникальный инструмент для изучения генетического влияния на поведение животных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Успешные стереотаксических инъекций полагаться на трех факторах: сохранение мышь жив, установив правильный нулевую точку для координат (кончик иглы на пересечении брегмы и межушной линии), и установив правильный глубину до нулевой точки (кончик иглы просто прикасаясь к наружной повер…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereotactic Apparatus item 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Quintessential stereotaxic pump | Stoelting co. | 53311 | |
| Injection Styringe, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| PEI | Polysciences Inc. | 23966 | |
| Scissors | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| Blunt end forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Needle holder | Fine Surgical Tools | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Microtorque control box, Tech2000 handpiece | with pedal |
| Glass bead sterilizer | Inotech | IS-400 | |
| Absorbable sutures | Unify | M-K518r19 | Absorbable, reverse cutting |
| Cotton swabs | VWR | 89031-270 | |
| Heating pad | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Artificial tears | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Disposable syringe | BD Syringe | 309623 | |
| Cloth | |||
| Gloves | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin or other anesthetic | see recipe citation | ||
| Ketoprofen or other analgesic | see veternarian | ||
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| Tracking Camera | Noldus | Media Recorder |
Referências
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).
- Hirrlinger, J., et al. Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo. PLoS One. 4 (1), 1-10 (2009).
- Fenno, L. E., et al. Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic. Nature Protocols. 11 (7), 763-772 (2014).
- Paxinos, G., Franklin, K. . The mouse brain in sterotaxic coordinates. , (2001).
- Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. Mood and anxiety related phenotypes in mice: the open field test. Humana Press. 42, 1-20 (2009).
- Denenberg, V. H. Open-field behavior in the rat: W.0hat does it mean. Annals of the New York Academy of Sciences. 159, 852-859 (1969).
- Bogdanova, O. V., Kanekar, S., D’Anci, K. E., Renshaw, P. F. Factors influencing behavior in the forced swim test. Physiology & Behavior. 118, 227-239 (2013).
- Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. Behavioral despair in rats: A new model sensitive to antidepressant treatments. European Journal of Pharmacology. 47 (4), 379-391 (1978).
- Hunsberger, J., Dunman, C. Animal models for depression-like and anxiety-like behavior. Nature Protocol Exchange. , (2007).
- Hommel, J. D., Sears, R. M., Georgescu, D., Simmons, D. L., DiLeone, R. J. Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference. Nature Medicine. 9 (12), 1539-1544 (2003).
- Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136 (6), 1017-1031 (2009).
- Clark, M. S., Sexton, T. J., McClain, M., Root, D., Kohen, R., Neumai, J. F. Overexpression of 5-HT1B receptor in dorsal raphe nucleus using herpes simplex virus gene transfer, increases anxiety behavior after inescapable stress. Journal of Neuroscience. 2 (11), 4550-4562 (2002).
- Tasan, R. O., et al. The central and basolateral amygdala are critical sites of neuropeptide Y/Y2 receptor-mediated regulation of anxiety and depression. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6282-6290 (2010).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protoc Hum Gen. 12 (12.10), (2007).
- Carter, D. A. Anesthetizing mice. Methods Mol Biol. 18, 135-136 (1993).
- Alachkar, A., Jiang, D., Harrison, M., Zhou, Y., Chen, G., Mao, Y. An EJC factor RBM8a regulates anxiety behaviors. Current Molecular Medicine. 13 (6), 887-899 (2013).
- Bernal, J., Baldwin, M., Gleason, T., Kuhlman, S., Moore, G., Talcott, M. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery. 22, 445-451 (2009).
- Wahlsten, D. Getting ready for testing. Mouse Behavioral Testing: How to use mice in behavioral neuroscience. Academic Press. , 133-141 (2011).
- Kheirbek, M. A., et al. Differential control of learning and anxiety along the dorso-ventral axis of the dentate gyrus. Neuron. 6 (77), 955-968 (2013).
- Snyder, J. S., Soumier, A., Brewer, M., Pickel, J., Cameron, H. A. Adult hippocampal neurogenesis buffers stress responses and depressive behaviors. Nature. 476 (7361), 458-461 (2011).
- Sik-Lee, J., et al. Induction of neuronal vascular endothelial growth factor expression by cAMP in the dentate gyrus of the hippocampus is required for antidepressant-like behaviors. Journal of Neuroscience. 29 (26), 8493-8505 (2009).
- Miller, D. G., Adam, M. A., Miller, A. D. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection. Molecular and Cellular Biology. 10 (8), 4239-4242 (1990).
- Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).
