Aplicando estereotáctica Técnica de Inyección para el Estudio de los efectos genéticos sobre Comportamientos animales
Summary
Inyección estereotáctica de lentivirus que expresan los ADNc o shRNAs pueden modular la expresión génica en áreas específicas del cerebro de los ratones. A continuación, presentamos un protocolo para combinar inyecciones estereotáxica con las tareas de comportamiento, como la prueba de campo abierto (OFT) y la prueba de natación forzada (FST).
Abstract
Inyección estereotáctica es una técnica útil para entregar los lentivirus de alto título a áreas del cerebro específicas en ratones. Los lentivirus pueden o bien sobreexpresan o la expresión de genes caída en una región relativamente centrado sin daño significativo al tejido cerebral. Después de la recuperación, el ratón inyectado puede ser probado en diversas tareas de comportamiento tales como la prueba de campo abierto (OFT) y la prueba de natación forzada (FST). El OFT está diseñado para evaluar la locomoción y el fenotipo de ansiedad en ratones mediante la medición de la cantidad de tiempo que un ratón pasa en el centro de un campo abierto novela. Un ratón más ansiosos pasará un tiempo significativamente menor en el centro del campo novela comparación con los controles. El FST evalúa el fenotipo anti-depresivo mediante la cuantificación de la cantidad de tiempo que los ratones pasan inmóvil cuando se coloca en un cubo de agua. Un ratón con un fenotipo anti-depresivo pasará significativamente menos inmóvil tiempo en comparación con los animales control. El objetivo de este protocolo es usar el sterinyección eotactic de un lentivirus, en relación con las pruebas de comportamiento para evaluar cómo los factores genéticos modular comportamientos animales.
Introduction
El ratón ha sido ampliamente utilizado en la neurobiología, porque es fácil de manipular genéticamente. Técnicas knockout de genes permiten a los investigadores para investigar cómo cada factor genético da forma a los comportamientos del ratón. Por otra parte, el sistema cre-loxP proporciona una valiosa herramienta para tejidos y tipo de células knockout de genes específicos en ratones, lo que permite a los investigadores estudiar la función de genes en diferentes tejidos. 1 Sin embargo, en la práctica, los patrones de expresión de los promotores cre son difíciles de controlar , y hasta ahora muchos conductores cre establecidos no han logrado específica de la región de expresión. 2,3
Alternativamente, inyección estereotáctica es un método que se dirige a regiones específicas del cerebro del ratón adulto. Mediante la inyección de virus manipulados genéticamente que expresan ADNc o shRNA, específica de la región de modulación de la expresión génica se puede lograr. Aunque el tamaño del cerebro de cada ratón varía, la localización de regiones específicas del cerebro se puede determinar usando coor estereotácticanates ajustar desde puntos de referencia en el cráneo del cerebro del ratón. Los puntos de referencia más utilizados son bregma, lambda, y la línea interaural. Usando coordenadas obtenidas de un atlas del cerebro, 4 la ubicación exacta de cada área del cerebro puede ser identificado por la antero-posterior (A / P), medial-lateral (M / L), y ventral-dorsal (D / V) de los ejes bregma / intersección línea interaural. Normalmente los virus se inyecta en el cerebro de ratones etiquetados, ya sea con la proteína fluorescente de color rojo o verde (RFP o GFP), por lo que las inyecciones pueden ser confirmados por microscopía fluorescente.
Evaluaciones de comportamiento de los ratones son especialmente necesarias para la investigación básica de los trastornos psiquiátricos. Los síntomas de los trastornos psiquiátricos en pacientes típicamente involucran comportamientos anormales. Algunos de estos comportamientos humanos son evolutivamente conservados y pueden ser imitado directamente observado en el ratón. Por ejemplo, la depresión puede ser modelado en el ratón mediante la medición de la desesperación conductual. Las personas con depresión oftes sentir como si nada lo hacen jamás ayudar, un síntoma que eventualmente puede conducir al suicidio. En los roedores, esto puede ser modelado utilizando la prueba forzada Swim (FST), que mide la cantidad de tiempo que un ratón nadando contra flotando en un charco de agua (vista como renunciar). Este paradigma se valida mediante el rescate del fenotipo con antidepresivos. 7,8,9 Los ratones que han recibido antidepresivos pasará significativamente menos inmóvil tiempo en comparación con los controles no tratados. Otra prueba de comportamiento, la prueba de campo abierto (OFT) está diseñado para evaluar la locomoción en ratones, y, además, puede ser utilizado para analizar el fenotipo de ansiedad en ratones. 5,6 Esta prueba se basa en la premisa de que los ratones se sienten más seguros cuando están cerca a la pared en un campo abierto novela. Ratones de tipo salvaje finalmente explorar la novela medio ambiente, ya que son animales curiosos. Sin embargo, gastar menos tiempo en el centro del campo indica la ansiedad en el ratón, como el ratón no será capaz de superar la initial miedo provocado por un nuevo entorno. La ansiedad del ratón, tal como se cuantifica por la cantidad de tiempo gastado en el centro de un campo abierto, se puede comparar a la ansiedad clínica en humanos, que está presente en muchos trastornos psiquiátricos.
La combinación de inyecciones estereotáxicas con paradigmas de comportamiento es una nueva manera de alterar la expresión de un gen específico en un área del cerebro específica. El efecto de la expresión génica modulada en los comportamientos del ratón se puede determinar. En contraste con knockout de todo el cerebro, este método es particularmente útil, ya que sólo se dirige a áreas específicas del cerebro. Además, las inyecciones estereotáxicas se realizan típicamente en el adulto tipo salvaje del ratón, por lo tanto, la expresión del gen endógeno se ha mantenido a lo largo de las etapas de desarrollo. Este método evitará el efecto confundir si se requiere el gen para la supervivencia durante la etapa embrionaria o postnatal de desarrollo. Una limitación importante es que los ratones experimentales necesitan ir through una cirugía invasiva, en la que los cráneos de ratones tienen que abrirse. Por otra parte, el grado de modulación gen se determina por el título y la eficiencia del virus. El virus necesita para ser inyectada en la región correcta usando coordenadas estereotácticas, que requiere instrumentos especiales. Verificación del sitio de inyección correcta sólo se puede completar post mortem.
Este método ha sido utilizado previamente para probar la implicación de un gen específico en diversas enfermedades neurológicas. Por ejemplo, viral RNAi mediada por la orientación del gen Th (que permite la dopamina a ser sintetizado) se inyectó en la sustancia negra compacta, y se llevó a cabo el análisis del comportamiento locomotor. 10 Otro estudio utilizó inyección estereotáctica de un DISC1 silenciamiento lentivirus para evaluar el comportamiento del ratón en relación a la esquizofrenia. Derribo de DISC1 llevó a un aumento de la locomoción en respuesta a la novedad (paralelismos síntomas positivos en la esquizofrenia), y una mayor inmovilidad en elFST. 11 De manera similar, un estudio adicional encontró que 5-HT 1B sobreexpresión condujo a un aumento de comportamiento exploratorio en el OFT, consistente con un fenotipo anti-ansiedad usando este método. 12 inyecciones estereotácticos pueden entregar virus para inducir recombinación cre en ratones cre-loxP . Este método se utiliza para eliminar selectivamente el receptor Y2 en la amígdala y el núcleo lecho de la estría terminal. Tras el análisis del comportamiento, estos ratones se encontraron a un fenotipo anti-depresivo cuando el gen fue suprimido en la amígdala central, pero sin fenotipo cuando el gen fue suprimido en la amígdala basolateral o la cama núcleo de la estría terminal. 13 Por lo tanto, esta técnica proporciona una herramienta única para estudiar el efecto genético sobre los comportamientos de los animales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inyecciones estereotáxicas exitosas se basan en tres factores: mantener el ratón vivo, estableciendo el punto cero correcto para las coordenadas (punta de la aguja en la intersección de bregma y la línea interaural) y ajuste de la profundidad adecuada para el punto cero (punta de la aguja apenas tocando el exterior del tejido cerebral). La viabilidad de los ratones es importante. Supervivencia cirugía puede ser ayudado por asegurarse de que el ratón es anestesiado correctamente y recibe analgésica adecuada. El do…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereotactic Apparatus item 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Quintessential stereotaxic pump | Stoelting co. | 53311 | |
| Injection Styringe, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| PEI | Polysciences Inc. | 23966 | |
| Scissors | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| Blunt end forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Needle holder | Fine Surgical Tools | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Microtorque control box, Tech2000 handpiece | with pedal |
| Glass bead sterilizer | Inotech | IS-400 | |
| Absorbable sutures | Unify | M-K518r19 | Absorbable, reverse cutting |
| Cotton swabs | VWR | 89031-270 | |
| Heating pad | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Artificial tears | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Disposable syringe | BD Syringe | 309623 | |
| Cloth | |||
| Gloves | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin or other anesthetic | see recipe citation | ||
| Ketoprofen or other analgesic | see veternarian | ||
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| Tracking Camera | Noldus | Media Recorder |
Referências
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