Tillämpa stereotaktisk injektion teknik för att studera genetiska effekter på djurens beteenden
Summary
Stereotaktisk injektion av lentivirus uttrycker cDNA eller shRNAs kan modulera genuttryck i specifika områden i hjärnan på möss. Här presenterar vi ett protokoll för att kombinera stereotaktiska injektioner med beteende uppgifter, till exempel Open Field Test (OFT) och tvångs Simma Test (FST).
Abstract
Stereotaktisk injektion är en användbar teknik för att leverera hög titer lentivirus riktade områden i hjärnan hos möss. Lentivirus kan antingen överuttrycker eller knockdown genuttryck i en relativt fokuserad region utan väsentlig skada på hjärnvävnaden. Efter återhämtning, kan den injicerade musen testas på olika beteende uppgifter såsom Open Field Test (OFT) och tvångs Simma Test (FST). OFT är utformad för att bedöma förflyttning och den oroliga fenotyp i möss genom att mäta den tid som en mus bringar i centrum av en ny öppet fält. En mer angelägen mus kommer att spendera betydligt mindre tid i mitten av den nya fältet jämfört med kontroller. FST bedömer antidepressiva fenotyp genom att kvantifiera den mängd tid som mössen tillbringar orörliga när de placeras i en hink med vatten. En mus med en anti-depressiv fenotyp kommer att spendera betydligt mindre tid orörlig jämfört med kontrolldjur. Målet med detta protokoll är att använda STEReotactic injektion av en lentivirus i samband med beteendetester för att bedöma hur genetiska faktorer modulerar djurbeteenden.
Introduction
Musen har använts i stor utsträckning i neurobiologi, eftersom det är lätt att manipulera genetiskt. Gene knockout tekniker tillåter forskare att undersöka hur varje genetisk faktor formar mus beteenden. Dessutom ger den cre-loxP-systemet ett värdefullt verktyg för vävnads- och cell typ- specifik gen knockout hos möss, vilket gör det möjligt för forskare att studera geners funktion i olika vävnader. 1 Men i praktiken, uttrycksmönster CRE promotorer är svåra att kontrollera , och så långt många etablerade CRE förare har inte uppnått regionspecifika uttryck. 2,3
Alternativt är stereotaktisk injektion en metod som inriktar sig på specifika områden i hjärnan av den vuxna musen. Genom att injicera genetiskt manipulerade virus som uttrycker cDNA eller shRNA, kan uppnås regionspecifik modulering av genuttryck. Även om hjärnans storlek av varje mus varierar, kan placeringen av specifika delar av hjärnan bestämmas med hjälp av stereotaktisk samordningennater in från landmärken på skallen av musen hjärnan. De mest vanligen använda landmärken är bregma, lambda, och den interaurala linjen. Använda koordinater som erhållits från en hjärnatlas, kan 4 vart varje hjärna område identifieras av antero-posterior (A / P), medial-laterala (M / L), och rygg-ventrala (D / V) axlar från bregma / interaural linje korsning. Typiskt virus injicerades i hjärnan hos möss är märkta med antingen rött eller grönt fluorescerande protein (RFP eller GFP), så att injektioner kan bekräftas genom fluorescerande mikroskopi.
Beteende bedömningar av möss är särskilt nödvändigt för grundforskning av psykiska störningar. Symtom på psykiatriska störningar hos patienter innebär vanligtvis onormala beteenden. Vissa av dessa humana beteenden är evolutionärt konserverade och kan direkt efterliknas och observeras i mus. Till exempel, kan depression modelleras i musen genom att mäta beteende förtvivlan. Personer med depression OFTsv känns som om ingenting de gör någonsin kommer att hjälpa, ett symptom som så småningom kan leda till självmord. Hos gnagare kan detta modelleras med hjälp av tvångs Simma Test (FST), som mäter den tid en mus simma kontra flytande i en pool av vatten (ses som att ge upp). Detta paradigm valideras genom att rädda fenotypen med antidepressiva. 7,8,9 Möss som fått antidepressiva kommer att spendera betydligt mindre tid orörlig jämfört med obehandlade kontroller. En annan beteendetestet, Open Field Test (OFT) är utformad för att bedöma förflyttning i möss, och dessutom kan användas för att analysera den oroliga fenotyp i möss. 5,6 Detta test är baserat på antagandet att möss känner sig tryggare när de är nära på väggen i ett nytt öppet fält. Möss av vildtyp kommer så småningom undersöka den nya miljön, eftersom de är nyfikna djur. Men tillbringa mindre tid i mitten av fältet indikerar ångest hos mus, som musen inte kommer att kunna övervinna inil rädsla orsakas av en ny miljö. Ångest av musen, som kvantifierades genom den mängd tid som tillbringas i mitten av ett öppet fält, kan jämföras med klinisk ångest hos människor, som är närvarande i många psykiatriska störningar.
Kombinationen av stereotaktiska injektioner med beteende paradigm är ett nytt sätt för att förändra uttrycket av en specifik gen på ett målinriktat hjärnområde. Effekten av modulerade genuttryck på mus beteenden kan sedan bestämmas. I motsats till hela hjärnan knockout, är denna metod speciellt användbar eftersom den endast inriktar sig på specifika områden i hjärnan. Dessutom är stereotaktiska injektioner vanligen utförs i den vuxna vildtyp mus därför endogen genexpression har upprätthållits under hela utvecklingsstadier. Denna metod kommer att undvika FÖRBRYLLA effekt om genen krävs för överlevnad under den embryonala eller postnatal utvecklingsstadium. En viktig begränsning är att de experimentella mössen behöver gå rakt igenomh en invasiv kirurgi, där skallarna hos möss måste öppnas. Dessutom är graden av gen module bestäms av titern och effektiviteten av viruset. Viruset måste sprutas in i rätt område med hjälp av stereotaktiska koordinater, som kräver särskilda instrument. Kontroll av korrekt injektionsstället kan bara slutföras efter slakt.
Denna metod har tidigare använts för att testa medverkan av en specifik gen i olika neurologiska sjukdomar. Exempelvis viralt medierad RNAi targeting TH-genen (som tillåter dopamin som skall syntetiseras) injicerades i substantia nigra compacta, och rörelsebeteendeanalys genomfördes. 10 En annan studie användes stereotaktisk injektion av ett lentivirus ljuddämpnings DISC1 att bedöma mus uppträdande i samband till schizofreni. Knockdown av DISC1 lett till ökad förflyttning som svar på nyhet (paralleller positiva symtom vid schizofreni), och större orörlighet iFST. 11 På samma sätt fann ytterligare en studie som 5-HT 1B uttryck ledde till ökad undersökande beteende i OFT, i linje med en anti-ångest fenotyp med denna metod. 12 stereotaktiska injektioner kan leverera CRE viruset att framkalla rekombination i cre-loxP möss . Denna metod användes för att selektivt ta bort Y2-receptom i amygdala och sängen kärnan av stria termin. Vid beteendeanalys, var dessa möss visade sig en anti-depressiv fenotyp när genen togs bort i den centrala amygdala, men ingen fenotyp när genen ströks i den basolateral amygdala eller sängen kärnan i stria termin. 13 Således, denna teknik ger ett unikt verktyg för att studera den genetiska påverkan på djurbeteenden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Framgångsrika stereotaktiska injektioner lita på tre faktorer: att hålla musen liv, ställa rätt nollpunkten för koordinaterna (nålspetsen på skärningspunkten mellan bregma och interaurala linje), och ställa rätt djup till nollpunkten (nålspetsen precis vidrör det yttre av hjärnvävnad). Den livskraft möss är viktigt. Kirurgi överlevnad kan underlättas genom att se till att musen är ordentligt sövda och får adekvat smärtstillande. Smärta är känd att vara en viktig orsak till dålig återhämtning…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereotactic Apparatus item 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Quintessential stereotaxic pump | Stoelting co. | 53311 | |
| Injection Styringe, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| PEI | Polysciences Inc. | 23966 | |
| Scissors | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| Blunt end forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Needle holder | Fine Surgical Tools | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Microtorque control box, Tech2000 handpiece | with pedal |
| Glass bead sterilizer | Inotech | IS-400 | |
| Absorbable sutures | Unify | M-K518r19 | Absorbable, reverse cutting |
| Cotton swabs | VWR | 89031-270 | |
| Heating pad | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Artificial tears | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Disposable syringe | BD Syringe | 309623 | |
| Cloth | |||
| Gloves | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin or other anesthetic | see recipe citation | ||
| Ketoprofen or other analgesic | see veternarian | ||
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| Tracking Camera | Noldus | Media Recorder |
Referências
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).
- Hirrlinger, J., et al. Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo. PLoS One. 4 (1), 1-10 (2009).
- Fenno, L. E., et al. Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic. Nature Protocols. 11 (7), 763-772 (2014).
- Paxinos, G., Franklin, K. . The mouse brain in sterotaxic coordinates. , (2001).
- Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. Mood and anxiety related phenotypes in mice: the open field test. Humana Press. 42, 1-20 (2009).
- Denenberg, V. H. Open-field behavior in the rat: W.0hat does it mean. Annals of the New York Academy of Sciences. 159, 852-859 (1969).
- Bogdanova, O. V., Kanekar, S., D’Anci, K. E., Renshaw, P. F. Factors influencing behavior in the forced swim test. Physiology & Behavior. 118, 227-239 (2013).
- Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. Behavioral despair in rats: A new model sensitive to antidepressant treatments. European Journal of Pharmacology. 47 (4), 379-391 (1978).
- Hunsberger, J., Dunman, C. Animal models for depression-like and anxiety-like behavior. Nature Protocol Exchange. , (2007).
- Hommel, J. D., Sears, R. M., Georgescu, D., Simmons, D. L., DiLeone, R. J. Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference. Nature Medicine. 9 (12), 1539-1544 (2003).
- Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136 (6), 1017-1031 (2009).
- Clark, M. S., Sexton, T. J., McClain, M., Root, D., Kohen, R., Neumai, J. F. Overexpression of 5-HT1B receptor in dorsal raphe nucleus using herpes simplex virus gene transfer, increases anxiety behavior after inescapable stress. Journal of Neuroscience. 2 (11), 4550-4562 (2002).
- Tasan, R. O., et al. The central and basolateral amygdala are critical sites of neuropeptide Y/Y2 receptor-mediated regulation of anxiety and depression. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6282-6290 (2010).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protoc Hum Gen. 12 (12.10), (2007).
- Carter, D. A. Anesthetizing mice. Methods Mol Biol. 18, 135-136 (1993).
- Alachkar, A., Jiang, D., Harrison, M., Zhou, Y., Chen, G., Mao, Y. An EJC factor RBM8a regulates anxiety behaviors. Current Molecular Medicine. 13 (6), 887-899 (2013).
- Bernal, J., Baldwin, M., Gleason, T., Kuhlman, S., Moore, G., Talcott, M. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery. 22, 445-451 (2009).
- Wahlsten, D. Getting ready for testing. Mouse Behavioral Testing: How to use mice in behavioral neuroscience. Academic Press. , 133-141 (2011).
- Kheirbek, M. A., et al. Differential control of learning and anxiety along the dorso-ventral axis of the dentate gyrus. Neuron. 6 (77), 955-968 (2013).
- Snyder, J. S., Soumier, A., Brewer, M., Pickel, J., Cameron, H. A. Adult hippocampal neurogenesis buffers stress responses and depressive behaviors. Nature. 476 (7361), 458-461 (2011).
- Sik-Lee, J., et al. Induction of neuronal vascular endothelial growth factor expression by cAMP in the dentate gyrus of the hippocampus is required for antidepressant-like behaviors. Journal of Neuroscience. 29 (26), 8493-8505 (2009).
- Miller, D. G., Adam, M. A., Miller, A. D. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection. Molecular and Cellular Biology. 10 (8), 4239-4242 (1990).
- Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).
