Apresentamos um método para a análise eletrorretinográfica (ERG) de larvas de peixe-zebra utilizando técnicas de micromanipulação e eletrorretinografia. Este é um método simples e direto para testar a função visual de larvas de peixe-zebra in vivo.
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Artigo de método
Eletrorretinograma Análise da Visual Response no peixe-zebra Larvas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O electrorretinograma (ERG) é um método não invasivo para a determinação electrofisiológico da função retiniana. Através da colocação de um eléctrodo sobre a superfície da córnea, a actividade eléctrica gerada em resposta à luz pode ser medido e utilizado para avaliar a actividade das células da retina in vivo. Este manuscrito descreve o uso do ERG para medir a função visual em peixe-zebra. Zebrafish têm sido utilizada como um modelo para o desenvolvimento dos vertebrados, devido à facilidade de supressão do gene por oligonucleótidos morfolino e manipulação farmacológica. Em 5-10 dpf, apenas cones são funcionais na retina das larvas. Por isso, o peixe-zebra, ao contrário de outros animais, é um sistema poderoso modelo para o estudo da função visual cone in vivo. Este protocolo utiliza anestesia standard, micromanipulação e protocolos lupa estereoscópica que são comuns em laboratórios que realizam pesquisa de peixe zebra. Os métodos descritos fazer uso de eq eletrofisiologia padrãouipment e uma câmera de luz baixa para orientar o posicionamento da microeletrodos gravação sobre a córnea larval. Finalmente, é mostrado como um ERG estimulador / gravador comercialmente disponível originalmente concebido para ser utilizado com os ratos podem ser facilmente adaptados para uso com o peixe-zebra. ERG de peixe-zebra larval proporciona um excelente método de ensaio de função visual cone em animais que tenham sido modificadas por morfolino injecção de oligonucleótidos, bem como mais recentes técnicas de engenharia do genoma, tais como nucleases dedo de zinco (ZFNs), activador de transcrição-Como efector As nucleases (TALENS), e Agrupamentos regularmente espaçadas Curtas Palindromic Repete (CRISPR) / Cas9, todos os quais têm aumentado consideravelmente a eficiência e eficácia do gene alvo em peixes-zebra. Além disso, tirar vantagem de a capacidade de agentes farmacológicos para penetrar larvas de peixes-zebra para avaliar os componentes moleculares que contribuem para o foto-resposta. Este protocolo descreve uma instalação que pode ser modificado e utilizado pelos investigadorescom vários objetivos experimentais.
Introdução
O electrorretinograma (ERG) é um método não invasivo electrofisiológico que tem sido amplamente utilizado na clínica para determinar a função da retina em seres humanos. A actividade eléctrica em resposta a um estímulo de luz é medida colocando os eléctrodos de gravação sobre a superfície externa da córnea. As características do paradigma do estímulo e a resposta forma de onda de definir os neurónios da retina que contribuem para a resposta. Este método foi adaptado para utilização com um número de modelos animais, incluindo ratinhos e peixes-zebra. A resposta típica do ERG vertebrado tem quatro componentes principais: a uma onda, que é um potencial negativo córnea p....
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Protocolo
Manutenção de animais e protocolos experimentais foram aprovados pelos cuidados e uso Comitês da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill Animais Institucional, e atender a todas as necessidades do Gabinete NIH of Laboratory Animal Welfare e da Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International.
NOTA: Para obter larvas para análise ERG, publicado protocolos para criação de peixe-zebra padrão e manutenção foram empregados 18. As larvas são obtidas através da reprodução natural e alojados sob um ciclo claro / escuro de 10 horas 14 horas de luz. Este protocolo foi optimizado para as larvas em 5-7 dias pós-fertilização (DPF), mas poderia ....
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Resultados
Normalmente, ERGs são registrados a partir de larvas do peixe em 5 dpf, uma vez que uma série de estudos publicados gravações ERG, nesta fase, 9, 16,20. Respostas larval foram medidos em condições de adaptação ao escuro, sem iluminação de fundo usando a 20 ms estímulo de luz LED branco. Utilizamos um sistema ERG comercialmente disponível consiste em um estimulador luz Ganzfeld e computador controller / gravador. O estimulador utiliza um sistema de modulação de largura de pulso rigidamente controlado proprietá.......
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Discussão
Neste protocolo um procedimento simples para gravações ERG de peixe-zebra larval é detalhado. Este procedimento permite uma análise rápida e abrangente de function.There visual são vários passos críticos em todo o procedimento que deve ser mantido em mente. O larvas do peixe deve ser saudável antes do experimento para impedir a morte durante os tratamentos potenciais da droga e garantir meios de subsistência prolongada durante as gravações do ERG. Além disso, é importante que as larvas utilizadas nas experiências são es.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros da instalação de aquicultura de peixe-zebra da UNC pela manutenção do peixe-zebra. Também gostaríamos de agradecer à Diagnosys, LLC pela assistência na configuração do aparelho ERG. Agradecimentos adicionais vão para a Dra. Portia McCoy e o laboratório do Dr. Ben Philpot pela assistência com os métodos eletrofisiológicos. Também gostaríamos de agradecer a Lizzy Griffiths por sua ilustração de um peixe-zebra larval. Este trabalho foi apoiado pelos prêmios F32 EY022279 do National Institutes of Health (para JDC) e R21 EY019758 (para EW).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Gaiola Faraday | 80/20 Inc | personalizado | "Conjunto de Eretor Industrial" de alumínio personalizado para estrutura de gaiola |
| Esponja PVA | Amazon | B000ZOWG1C | Fornece uma plataforma macia e úmida para colocação de larvas de peixe-zebra |
| Sistemas de filtro estéril de 150 ml | 431154 Corning | para evitar que pequenas articulações bloqueiem micropipetas | |
| Espion E2 | Contato Diagnosys, LLC | Sistema modular de eletrofisiologia capaz de gerar estímulos visuais para qualquer estimulador e gravação digital e análise de respostas usando software proprietário, mais informações em http://www.diagnosysllc.com | |
| Contato Colordome | Diagnosys, LLC | Estimulador de luz com LED RGB e fontes de luz de xenônio para Ganzfeld ERG, mais informações em http://www.diagnosysllc.com | |
| Micromanipulador | Drummond | 3-000-024-R | Segurar e posicionar o microeletrodo de gravação |
| Suporte de anel magnético | Drummond | 3-000-025-MB | Segurar e posicionar a câmera e o eletrodo de referência |
| Extensões de eletrodo | Grass Technologies | F-LX | Cabos de chumbo sobressalentes fêmea para macho de 1,5 mm para conectar eletrodos |
| Pino macho para fêmea Adaptador SAFELEAD Grass | Technologies | DF-215/10 | Conectando pinos de 2 mm a pinos de cabeceira de 1,5 |
| Moldura de tela de janela (metal) e ranhura | Lowes ou Home Depot | vários | Para fixar malha de cobre à estrutura da gaiola de Faraday |
| Filtros Steriflip 50 ml | Millipore | SCGP00525 | Soluções de filtragem para evitar que pequenas articulações bloqueiem micropipetas |
| Adaptador BNC | Monoprice | 4127 | Conectando câmera ao cabo BNC |
| Cabo BNC | Monoprice | 626 | Conectando a câmera ao adaptador de vídeo Lente |
| câmera | Navitar | 1582232 | Visualizando o posicionamento do microeletrodo de gravação na córnea larval |
| Acoplador da câmera | Navitar | 1501149 | Visualizando o posicionamento do microeletrodo de gravação na córnea larval |
| Luna Conversor BNC para VGA + HDMI | Sewell | SW-29297-PRO | Adaptador BNC para VGA que permite que a imagem da câmera seja projetada no monitor do computador |
| APB | Sigma | A1910 | agonista mGluR6, bloqueia a onda b permitindo a análise do potencial receptor de massa do cone isolado |
| Vidro borossilicato | Sutter | BF-150-86-10 | Vidro borossilicato polido a fogo (temperatura de medição = 821° C) com filamento e dimensões de 1,5mm x 0,86 mm (diâmetro externo por diâmetro interno) |
| P97 Extrator flamejante/marrom | Sutter | P97 | Para puxar micropipetas de vidro |
| Folha de Sorbothane | Thorlabs | SB12A | Polímero de uretano viscoelástico sintético, colocado sob Montagens de Isolamento Passivo e plataforma ERG para absorver choques e evitar escorregamentos, pode ser cortado à medida |
| Placa de ensaio | Thorlabs | B2436F | Plataforma de isolamento de vibração para estimulador ERG e espécime |
| de peixe-zebraMontagens de isolamento passivo | Thorlabs | PWA074 | Fornece isolamento de vibração para placa de ensaio |
| Malha de cobre | TWP | 022X022C0150W36T | de gaiola de Faraday |
| VWR | 53502-233 | Usado com pipetas Pasteur para transferir cuidadosamente larvas de peixe-zebra | |
| Pipetas Pasteur | VWR | 14672-608 | Usado com bomba de pipeta para transferir cuidadosamente larvas de peixe-zebra |
| Câmera | Watec | WAT-902B | Visualizando o posicionamento do microeletrodo de gravação na córnea larval |
| Tricaína (MS-222) | Western Chemical | Tricaine-S | Anestésico de grau farmacêutico,Micro-fil |
| WPI | MF28G-5 | Suporte de microeletrodo de enchimento e vidro de microeletrodo | |
| Suporte de microeletrodo | WPI | MEH2SW15 | Segura microeletrodo de vidro, conecta-se ao equipamento ERG |
| Eletrodo de referência | WPI | DRIREF-5SH | Quebre cuidadosamente o último centímetro do invólucro para drenar o eletrólito e exponha o eletrodo de pellets Ag/AgCl sinterizado |
| Eletrodo de referência (alternativa) | WPI | EP1 | Alternativa ao DRIREF-5SH. Eletrodo Ag/AgCl que deve ser conectado/soldado ao cabo de conexão |
| Cabo de baixo ruído para suporte de microeletrodo | WPI | 13620 | Conectando o suporte de microeletrodo de gravação ao adaptador/cabeceira |
Referências
- Dowling, J. E. The retina: an approachable part of the brain. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1987).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, ....
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Reimpressões e permissões
