Mänskliga multipelt myelom (MM) celler kräver stödjande mikromiljö av mesenkymala celler och extracellulära matriskomponenter för överlevnad och proliferation. Vi etablerade en in vivo kycklingembryo modell med engrafted humana myelom och mesenkymala celler för att studera effekterna av cancerläkemedel på tumörtillväxt, invasion och angiogenes.
Multipelt myelom (MM), en malign plasmacellsjukdom, förblir obotlig och nya läkemedel krävs för att förbättra prognosen för patienter. På grund av bristen på benet mikro och auto / parakrint tillväxtfaktorer mänskliga MM celler är svåra att odla. Därför finns det ett akut behov av att fastställa korrekt in vitro och in vivo odlingssystem för att studera effekten av nya läkemedel på humana MM celler. Här presenterar vi en modell för att odla humana multipla myelomceller i en komplex 3D-miljö in vitro och in vivo. MM cellinjer OPM-2 och RPMI-8226 transfekterades för att uttrycka transgenen GFP och odlades i närvaro av humana mesenchymala celler och kollagen typ-I-matris som tredimensionella sfäroider. Därutöver har sfäroider ympas på korioallantoinmembranet (CAM) hos kycklingembryon och tumörtillväxt övervakades genom stereo fluorescensmikroskopi. Båda modellerna tillåter studier av nya terapeutiska drugs i en komplex 3D-miljö och kvantifiering av tumörcellmassan efter homogenisering av transplantat i en transgen-specifik GFP-ELISA. Dessutom kan angiogena svar i värd och invasion av tumörceller i den underliggande värdvävnaden övervakas dagligen av en stereolupp och analyserades genom immunohistokemisk färgning mot humana tumörceller (Ki-67, CD138, Vimentin) eller värdväggceller som täcker blodkärl (desmin / ASMA).
Sammanfattningsvis tillåter onplantelement systemet studerar MM celltillväxt och angiogenes i en komplex 3D-miljö och möjliggör screening för nya terapeutiska substanser som verkar överlevnad och spridning av MM-celler.
Multiple myeloma (MM) is characterized by proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow, bone lesions and immunodeficiency 1. Although new treatment options such as proteasome inhibitors (bortezomib) and immune modulatory drugs (pomalidomide and lenalidomide) are available, MM still remains an incurable malignancy with a grim prognosis 2. The bad prognosis might be explained by the extraordinary heterogeneity of MM cell clones that contributes to variable responses to therapy, in particular under long time treatment and selection pressure of MM clones 3.
Preclinical testing of new drugs and their combinations in vitro and in vivo is a critical and time-consuming step for future drug development. Thus, useful in-vivo models of MM are required to gain a better understanding of the biology of the disease and to enable the discovery of new drugs. Actually, the best xenotransplantation models for hematological malignancies and therapeutics are immune-deficient mice, such as the severe-combined immunodeficient (SCID) mice 4-7, the non-obese diabetic/SCID (NOD/SCID) mice 8,9 or the β-microglobulin-knockout NOD/SCID mice 10,11.
Although murine models of human MM in some aspects can resemble the phenotype of human disease, immune-deficient mice are inbred, therefore simulate only one individual response to a drug and costs are very high. Due to immunosuppression animals require special maintenance conditions and the engraftment of human MM in mice requires 6 weeks to 2 months 9,12, unless cells are grafted directly to the bone marrow using a technically demanding procedure with lower rates of animal survival 7,13. Therefore, new methods using stem-cell based organoid models 14, tissue engineering 15 or sophisticated 3D cell culture models 16 have been established. They will compete in the near future with classical animal experiments for preclinical drug testing, but cannot replace systemic toxicity tests in living organisms.
The chicken embryo has been demonstrated before to be a suitable organism for xenotransplantation of human cells and tissues due to lack of adaptive immune response until hatching 17-19. Moreover, each chicken embryo reflects an individual reaction to applied drugs or tumor cells due to genetic diversity within the chicken population. The chorioallantoic membrane (CAM) is a well-established system to study tumor-dependent angiogenesis 20-22. When solid tumors are grafted to the CAM, they display many characteristics of cancers in vivo, including proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis 23-27.
Based on the previous experience of our group with CAM xenograft models20,26,27, a human MM model was established that combines the advantage of a human 3D culture system with the model of ex ovo developing chicken embryos. This MM model system allows real time monitoring of MM growth progression, quantification of cell mass and preclinical drug testing.
Utvecklingen av nya terapeutiska medel för eldfasta MM kräver mindre tidskrävande och kostsamma in vivo system för att utvärdera känsligheten hos humana MM celler till droger. Hittills endast ett fåtal in vivo system finns tillgängliga för preklinisk utvärdering av nya anti-myelom terapier. Alla av dem har sina begränsningar för storskalig screening av substansbibliotek 29.
De bästa nuvarande modeller för mänskliga MM celler är starkt immundefekta möss 7,13,30 och kalk…
The authors have nothing to disclose.
The authors want to thank Ms. Cornelia Heis for her excellent technical assistance in immunohistochemistry and preparation of chicken embryos. This work was supported by the Austrian Science Fund (FWF Grant No. P19552) and the European Union (EU FP7 project Optatio No: 278570).
RPMI-8226 cells | DSMZ | ACC 9 | STR profiled |
OPM-2 cells | DSMZ | ACC 50 | STR profiled |
Human mesenchymal stem cells | PromoCell | PC-C-12974 | |
HEK293FT cells | Invitrogen | R700-07 | |
RPMI1640 Medium | Sigma Aldrich | R0883 | |
Fetal Bovine Serum HyClone | ThermoScientific | SH30070.03 | |
L-Glut- Pen- Strep solution | Sigma | G6784 | |
DMEM Medium | Gibco | 31966 | |
NEAA | Sigma Life Sciences | M7145 | |
Transfection Medium/Opti-MEM | Gibco | 51985 | |
eGFP lentiviral particles | GeneCopoeia | LPP-EGFP-LV105 | Ready to use viral particles |
pLenti6/V5Dest6 eGFP vector | Invitrogen | PN 35-1271 | from authors |
ViralpowerTM packaging mix | Invitrogen | P/N 35-1275 | |
Transfection reagent/ Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
Blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
Neomycin | Biochrom | A2912 | |
Collagen-Type1 Rat Tail | BD Biosciences | 354236 | |
DMEM powder | Life Technologies | Art.Nr. 10338582 | |
plitidepsin | Pharmamar | ||
bortezomib | LKT Lab., Inc. | B5871 | |
SPF-white hen eggs | Charles River | Fertilized white Leghorn chicken eggs | |
Plastic weighing boats | neoLab | Art.Nr. 1-1125 | for ex-ovo culture |
Petridish square (Lids) | Simport | D210-16 | for ex-ovo culture |
RIPA Buffer (10x) | Cell Signaling | #9806 | |
Protease Inhibitor Tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
Complete Mini EDTA-free | |||
GFP ELISA | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
Histocette II | Simport | M493-6 | |
PFA 37% | Roth | 7398.1 | |
DPBS | Lonza | BE17-512F | |
Ethanol absolut | Normapur | 20,821,321 | |
Roti-Histol | Roth | Art.Nr.6640.4 | |
Paraplast | Sigma | A6330 | |
SuperFrost Microscope Slides | R. Langenbrinck | Art.-Nr. | |
Labor- u. Medizintechnik | 03-0060 | ||
DakoCytomation Wash Buffer 10x | DakoCytomation | Code-Nr. | |
S 3006 | |||
Target Retrieval Solution (10x) pH 6,1 | DAKO | Code-Nr. | |
S 1699 | |||
H2O2 | Merck | ||
m-a-hu ASMA clone 1A4 | DAKO | M0851 | |
m-a-hu CD138 clone MI15 | DAKO | M7228 | |
m-a-hu Vimentin clone V9 | DAKO | M0725 | |
m-a-hu Desmin clone D33 | DAKO | M0760 | |
m-a-hu Ki67 clone MIB-1 | DAKO | M7240 | |
biotinylated goat- anti-mouse IgG | Vector Laboratories Inc. | BA-9200 | |
Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories Inc. | # PK-6100 | |
FAST DAB Tablet Set. | Sigma Biochemicals | # D4293 | |
Mayer’s haemalaun solution | Merck | 1,092,490,500 | |
Roti Histokitt | Roth | Art.Nr.6638.2 | |
Bench top rotary microtome | Thermo Electron, Shandon Finesse ME+ | ||
Tissue embedding station | Leica, TP1020 | ||
Egg-Incubator | Grumbach | BSS160 | |
Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light | Olympus, SZX10 | ||
Ultra Turrax | IKA T10 | Homogenizer |