This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.
Experimentele diermodellen van een beroerte zijn van onschatbare waarde tools voor het begrijpen van een beroerte pathologie en het ontwikkelen van meer effectieve behandeling strategieën. Een 2 week protocol voor repetitieve hypoxische preconditionering (RHP) induceert langdurige bescherming tegen het centrale zenuwstelsel (CNS) letsel in een muismodel van focale ischemische beroerte. RHP bestaat uit 9 stochastische blootstelling aan hypoxie die variëren in zowel duur (2 of 4 uur) en de intensiteit (8% en 11% O2). RHP vermindert infarct volumes bloed-hersen barrière (BBB) verstoring, en de post-stroke ontstekingsreactie weken na de laatste blootstelling aan hypoxie suggereert een langdurige inductie van een endogene CNS-beschermende fenotype. De methode voor de dubbele kwantificering van infarct volume BBB verstoring is doeltreffend worden geëvalueerd neurovasculaire bescherming bij muizen met RHP of andere putatieve neuroprotectieve. Volwassen mannelijke Swiss Webster muizen werden geconditioneerd door RHP of duur equivalent blootstelling aan 21% O <sub> 2 (dwz kamer lucht). Een 60 min voorbijgaande midden cerebrale slagader occlusie (tMCAo) werd geïnduceerd 2 weken na de laatste hypoxische blootstelling. Zowel de occlusie en reperfusie werden bevestigd door transcraniële laser Doppler flowmetry. Tweeëntwintig uur na reperfusie, Evans Blue (EB) werd intraveneus toegediend via een injectie in de staartader. 2 uur later werden de dieren opgeofferd door een overdosis isofluraan en hersencoupes werden gekleurd met 2,3,5- trifenyltetrazoliumchloride (TTC). Infarcten volumes werden vervolgens gekwantificeerd. Vervolgens EB geëxtraheerd uit het weefsel dan 48 uur om BBB storing te bepalen na tMCAo. Samengevat, RHP is een eenvoudig protocol dat kan worden gerepliceerd, met minimale kosten, langdurige bescherming tegen endogeen neurovasculaire beroerte letsel bij de muis, de translationele potentieel voor andere CNS-gebaseerde en systemische pro-inflammatoire ziektetoestanden.
Aangezien de voornaamste oorzaak van volwassen gehandicapten en de vierde doodsoorzaak, beroerte is één van de meest slopende ziekten tegenover de volwassen bevolking van de Verenigde Staten. 1 Diermodellen van een beroerte zorgen voor experimenteel onderzoek van nieuwe methoden ter vermindering van ischemische schade en het verbeteren van post-stroke herstel. Een roman avenue voor dergelijke translationeel onderzoek is preconditionering. Voorbehandeling het opzettelijk gebruik van een niet schadelijk stimulus om de schade op een volgende, en ernstiger letsel. 2 hypoxische preconditionering is aangetoond pleiotrope veranderingen in de hersenen die bescherming bieden tegen beroerte in zowel in vivo als in vitro studies produceren . 3 echter eenmalige blootstelling aan hypoxia biedt slechts kortdurende neuroprotectie, induceren minder dan 72 uur van tolerantie tegen ischemie bij volwassen muizen. 4 zelfs na vier weken van 14 uur dagelijkse blootstelling aan hypoxie hypobaric, Lin et al. found dat neuroprotectie werd volgehouden slechts één week. 5 Repetitive hypoxische preconditionering (RHP) wordt gekenmerkt door stochastische variaties in frequentie, duur en intensiteit van hypoxische blootstelling. In tegenstelling tot een voorbehandeling uitdaging RHP induceert een cerebroprotective fenotype die blijft tot acht weken bij muizen. 6 RHP verminderd infarct volumes bloed-hersen barrière (BBB) verstoring, vasculaire inflammatie, en leukocyt diapedesis weken na de laatste hypoxische blootstelling . RHP bijzonder verminderde ontsteking in de ischemische hersenen door verlaging van T-cel, monocyt en macrofaag populaties, met behoud van B-celpopulaties in de ischemische hemisfeer. 7 In feite, RHP induceerde een immunosuppressief fenotype bij muizen vóór elke CNS letsel, waaronder beroerte. RHP-behandelde B-cellen geïsoleerd uit RHP behandelde gezonde muizen vertoonden een unieke anti-inflammatoir fenotype, met een neerwaartse regulatie van zowel antigeenpresentatie en antilichaamproductie. Dealgehele vermindering van pro-inflammatoire antigeen-specifieke afweermechanismen maakt RHP een uitstekende methode om endogene immunosuppressie te induceren niet alleen CNS-specifieke ontstekingsziekten, maar ook systemische verwondingen of ziekte modellen met een pro-inflammatoire pathologie omvatten.
RHP vermindert zowel infarct volume en BBB verstoring na een voorbijgaande midden cerebrale slagader occlusie (tMCAo). Diermodellen van beroerte, zoals de algemeen gebruikte tMCAo, drastisch verbeteren van het begrip van de pathofysiologie van beroerte, alsook het ontwerpen van effectievere Neurotherapeutics. Eerst ontwikkeld door Koizumi et al., In 1986, 8 de tMCAo procedure is een veel gebruikte werkwijze voor het induceren van een beroerte bij knaagdieren en één van de voorkeurswerkwijzen voor het onderzoeken van ontsteking na reperfusie. Als werkwijzen voor tMCAo evolueren, de meer recente gebruik van met silicone beklede filamenten verder het risico van subarachnoïdale bloeding te verminderen in vergelijking met andere modellen 9,10 </ Sup> en het verbeteren van de betrouwbaarheid, maar helaas tMCAo levert vaak een grote variatie in infarct volumes. 11-13 De meeste van deze studies af te bakenen infarct gebieden in coronale hersenen secties door kleuring met 2,3,5- trifenyltetrazoliumchloride (TTC), beschouwd als een gouden standaard voor kwantificatie infarct omdat het een eenvoudige en goedkope manier om levendige, reproduceerbare resultaten. TTC dient als een substraat van dehydrogenasen aanwezig in mitochondria. Wanneer hersenplakjes worden blootgesteld aan het TTC-oplossing wordt TTC selectief in levende cellen genomen als de niet-oplosbare reductieproduct, formazan, precipiteert een dieprode kleur in levensvatbare mitochondria. Omwille van mitochondriale dysfunctie in de ischemisch weefsel, dit weefsel blijft wit, waardoor voor differentiatie van beschadigde en gezond weefsel. 14
RHP vermindert ook BBB verstoring in de ischemische hemisfeer. 6 Daarom is de dubbele kwantificering van BBB integriteit binnen dezelfde Bregens als TTC-gebaseerde infarct volumebepalingen 15 nuttige informatie opleveren over de volledige werking van endogene bescherming en mogelijke causale verbanden tussen BBB verstoring en infarct bij onbehandelde en behandelde dieren te verschaffen. De instroom van perifeer bloed door een verstoorde BBB, secundaire beroerte, neemt leukocyt populaties, pro-inflammatoire cytokines, oxidatieve stress, vasogeen oedeem, en hemorragische transformatie in de ischemische hemisfeer uiteindelijk uitgebreid aantal besmettingen en mortaliteit bij patiënten met ischemische beroerte . 16,17 Een gebruikelijke meetmethode BBB verstoring in diermodellen met kwantificering van Evans blue (EB) kleurstof lekken in de hersenen. 15,18-21 EB selectief bindt aan albumine, een globulair eiwit serum (MW = 65 kDa) dat maakt de BBB niet oversteken ongedeerd dieren. 22 Naar aanleiding van ischemische beroerte, EB infiltreert de hersenen, en fluoresceert bij 620 nm, waardoor voor het meten van de optische dichtheid within geperfundeerde gewonden parenchym. 22 De extinctie is recht evenredig met de permeabiliteit van de BBB bij EB van transcardiale perfusie verricht van de post-mortem corticale vasculatuur gewassen. Met de onmiddellijke verwerking van TTC-gekleurd hersenen bij dieren met EB toediening kan zowel het infarct volume en BBB verstoring effectief worden gekwantificeerd. Opgemerkt zij echter dat neuronaal letsel en BBB verstoring niet gelijktijdige processen in de hersenen na een beroerte, 23,24 zodat de selectie van de tijd van offeren is een belangrijke overweging.
Het protocol dat volgt geeft de RHP werkwijze de tMCAo werkwijze voor het induceren van een tijdelijke arteriële occlusie die modellen middelste cerebrale arterie occlusie bij menselijke patiënten, en de dubbele histologische methoden om neurale en vasculaire beroerte letsel eindpunten. TTC meet celdood en cumulatief weefselschade, waardoor de kwantificering van de totale infarct volume, terwijl EB voorziet in de hemisferische kwantificering van BBB schade.
Een enkele blootstelling aan systemische hypoxie (dat wil zeggen, 2 uur van 11% O 2) bij muizen "tijdelijk" beschermt de hersenen tegen tMCAo, 29 betekent dat de epigenetische antwoord op de hypoxische preconditionering uitdaging is de korte levensduur, en de basislijn fenotype wordt hersteld binnen dagen. Repetitieve presentaties van de hypoxische preconditionering stimulus dramatisch verlengen van de duur van de neuroprotectieve fenotype. 6 Vele studies hebben aanget…
The authors have nothing to disclose.
Special thanks to the Gidday lab for their work in developing the RHP protocol, as well as the Neuro-Models Facility (UTSW) for their assistance in the tMCAo surgeries. This work was supported by grants from the American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS), and The Spastic Paralysis Research Foundation of the Illinois-Eastern Iowa District of Kiwanis International (JMG).
Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
15L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8mm diameter probe |
High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
250 mL isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
3mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
0.3cc insulin syringe with 29 g needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
TTC | Sigma | T8877 | |
10X PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
27g winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
1.7 mL microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |