Quantification de la protection neurovasculaire Après répétitive hypoxique préconditionnement et transitoire Moyen Cerebral Artery Occlusion chez la souris
Summary
This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.
Abstract
Des modèles animaux expérimentaux de course sont des outils précieux pour la compréhension de la pathologie course et élaborer des stratégies de traitement plus efficaces. Un protocole 2 de semaine pour répétitif préconditionnement hypoxique (RHP) induit une protection à long terme contre les blessures du système nerveux central (SNC) dans un modèle de souris d'accident vasculaire cérébral ischémique focal. RHP se compose de 9 stochastiques exposition à l'hypoxie qui varient à la fois dans la durée (2 ou 4 heures) et l'intensité (8% et 11% de O 2). RHP réduit les volumes d'infarctus, barrière hémato-encéphalique (BHE) la perturbation, et la réponse inflammatoire post-AVC pendant des semaines après la dernière exposition à l'hypoxie, suggérant une induction à long terme d'un phénotype SNC-protection endogène. La méthodologie pour la quantification de double volume de l'infarctus et de rupture de la BHE est efficace dans l'évaluation de la protection neurovasculaire chez des souris avec RHP ou d'autres neuroprotecteurs putatifs. Souris mâles adultes Swiss Webster ont été préconditionnés par RHP ou expositions d'une durée équivalente à 21% O <sub> 2 (c.-à-air de la pièce). A 60 min transitoire occlusion de l'artère cérébrale moyenne (tMCAO) a été induite deux semaines après la dernière exposition hypoxique. Tant l'occlusion et la reperfusion ont été confirmées par Doppler transcrânien débitmétrie laser. Vingt-deux heures après la reperfusion, Bleu Evans (EB) a été administré par voie intraveineuse par une injection veine de la queue. 2 heures plus tard, les animaux ont été sacrifiés par sections de surdosage et le cerveau isoflurane ont été marqués par 2,3,5 chlorure de triphényltétrazolium (TTC). Volumes infarctus ont ensuite été quantifiés. Ensuite, EB a été extrait du tissu de plus de 48 heures pour déterminer rupture de la BHE après tMCAO. En résumé, RHP est un protocole simple qui peut être reproduit, avec un coût minimal, pour induire une protection neurovasculaire endogène à long terme des blessures de course chez les souris, avec le potentiel de translation pour d'autres états pathologiques pro-inflammatoires SNC-base et systémiques.
Introduction
Comme la première cause de handicap des adultes et la quatrième cause de décès, accident vasculaire cérébral est l'un des états pathologiques les plus débilitantes face à la population adulte des États-Unis. 1 Les modèles animaux d'AVC permettent pour une étude expérimentale de nouvelles méthodes de réduction de la lésion ischémique et améliorer la récupération post-AVC. Une nouvelle avenue pour une telle recherche translationnelle est préconditionnement. Préconditionnement est l'utilisation intentionnelle d'un stimulus non dommageable pour réduire les dommages causés par une suite, et plus grave, de blessure. 2 hypoxique préconditionnement a été montré pour produire des changements pléiotropiques dans le cerveau qui assurent une protection contre la course à la fois in vivo et des études in vitro . 3 Cependant, une seule exposition à l'hypoxie ne propose que la neuroprotection court terme, induisant moins de 72 heures de la tolérance contre l'ischémie chez la souris adulte. 4 Même après quatre semaines de 14 h expositions quotidiennes à l'hypoxie hypobare, Lin et al. found que neuroprotection n'a été maintenue pendant une semaine. 5 préconditionnement hypoxique répétitive (RHP) est caractérisée par des variations stochastiques fréquence, la durée et l'intensité des expositions hypoxiques. Contrairement à un défi de préconditionnement unique, RHP induit un phénotype cérébroprotecteur qui dure jusqu'à huit semaines chez la souris. 6 RHP réduit volumes d'infarctus, barrière hémato-encéphalique (BHE) perturbation, l'inflammation vasculaire, et la diapédèse des leucocytes pour semaines après l'exposition hypoxique finale . RHP spécifiquement réduit l'inflammation dans le cerveau ischémique en réduisant les lymphocytes T, les monocytes, et les populations de macrophages, tout en maintenant les populations de cellules B dans l'hémisphère ischémique. 7 En fait, RHP induit un phénotype immunosuppressive chez les souris avant toute lésion du SNC, y compris les accidents vasculaires cérébraux. Les cellules B-RHP isolées de souris traitées sain RHP traitées présentaient un phénotype anti-inflammatoire unique, avec une régulation à la baisse à la fois de la présentation d'antigène et la production d'anticorps. Leréduction globale des mécanismes immunitaires adaptatives pro-inflammatoires rend RHP une excellente méthode pour induire une immunodépression congénitale non seulement pour les maladies inflammatoires du système nerveux central spécifiques, mais également des modèles de blessures ou de maladies systémiques qui comprennent une pathologie pro-inflammatoire.
RHP réduit à la fois le volume de l'infarctus et rupture de la BHE après une occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne (tMCAO). Les modèles animaux d'AVC, comme l'couramment utilisés tMCAO, améliorer considérablement la compréhension de la physiopathologie de la course, ainsi que la conception de neurothérapeutiques plus efficaces. Première développé par Koizumi et al., En 1986, 8 la procédure tMCAO est une méthode largement utilisée d'induire AVC chez les rongeurs et l'une des méthodes privilégiées pour enquêter sur l'inflammation qui suit la reperfusion. Comme les méthodes de tMCAO évoluent, l'utilisation plus récente de filaments revêtus de silicone réduire davantage le risque d'hémorragie sous-arachnoïdienne par rapport aux autres <9,10/ Sup> et améliorer la fiabilité, mais malheureusement tMCAO produit souvent une grande variation du volume de l'infarctus. 11 à 13 La plupart de ces études délimiter des régions d'infarctus dans les sections coronales de cerveau par coloration avec du chlorure de 2,3,5- triphényltétrazolium (TTC), considéré comme un étalon-or pour l'infarctus quantification, car il est un moyen simple et peu coûteux à produire vives, les résultats reproductibles. TTC sert de substrat des déshydrogénases présents dans les mitochondries. Lorsque des tranches de cerveau sont exposés à la solution TTC, TTC est prise de manière sélective dans des cellules vivantes où son produit de réduction non-soluble, formazan, précipite à une couleur rouge foncé dans les mitochondries viables. En raison de la dysfonction mitochondriale dans le tissu ischémique, ce tissu reste blanche, permettant la différenciation des tissus endommagés et en bonne santé. 14
RHP réduit également BBB perturbation dans l'hémisphère ischémique. 6 Par conséquent, la double quantification de BBB intégrité au sein de la même bpluies que le volume de l'infarctus base-TTC déterminations de 15 fournirait des informations utiles sur la pleine efficacité de la protection endogène, et les relations de cause à effet possibles entre rupture de la BHE et d'infarctus chez les animaux traités et non traités. L'afflux de sang périphérique à travers un BBB perturbé, secondaire à un AVC, augmente les populations de leucocytes, les cytokines pro-inflammatoires, stress oxydatif, oedème vasogénique et transformation hémorragique dans l'hémisphère ischémique, finalement, l'augmentation des taux d'infection et de mortalité chez les patients ayant subi un AVC ischémique . 16,17 Un procédé courant de rupture de la BHE de mesure dans des modèles animaux se fait par la quantification de bleu d'Evans (EB) de fuite de colorant dans le cerveau. 15,18-21 EB se lie sélectivement à l'albumine sérique, une protéine globulaire (PM = 65 kDa) qui ne traverse pas la BHE chez les animaux non lésés. 22 Après un AVC ischémique, EB infiltre le cerveau, et émet une fluorescence à 620 nm, ce qui permet pour la mesure de la densité optique within le parenchyme blessés perfusé. 22 La densité optique est directement proportionnelle à la perméabilité de la BBB lorsque EB a été lavé de la vascularisation corticale post-mortem par perfusion transcardiaque. Avec la transformation immédiate des cerveaux TTC colorées chez l'animal avec l'administration EB, à la fois le volume de l'infarctus et rupture de la BHE peuvent être efficacement quantifiés. Il convient de noter, toutefois, que les lésions neuronales et rupture de la BHE sont pas des processus concomitants dans le cerveau post-AVC, 23,24 sorte que la sélection du temps de sacrifice est une considération importante.
Le protocole qui suit détaille la méthode RHP, la méthode tMCAO pour induire une occlusion artérielle temporaire qui modèles intermédiaires occlusions de l'artère cérébrale chez des patients humains, et les méthodes à double histologiques pour déterminer neuronaux et vasculaires extrémités des blessures de course. TTC mesure la mort cellulaire et des lésions tissulaires cumulative, ce qui permet la quantification d'un infarctus volume globalume, tandis EB fournit pour la quantification hémisphérique de dommages Bureau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une seule exposition à l'hypoxie systémique (soit 2 h de 11% O 2) chez la souris protège "transitoire" le cerveau de tMCAO, 29 signifie la réponse épigénétique à la hypoxique défi préconditionnement est de courte durée, et le phénotype de base est rétablie dans jours. Présentations répétitives de la relance préconditionnement hypoxique étendent considérablement la durée du phénotype neuroprotecteur. 6 De nombreuses études ont montré que la fr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Special thanks to the Gidday lab for their work in developing the RHP protocol, as well as the Neuro-Models Facility (UTSW) for their assistance in the tMCAo surgeries. This work was supported by grants from the American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS), and The Spastic Paralysis Research Foundation of the Illinois-Eastern Iowa District of Kiwanis International (JMG).
Materials
| Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
| 21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
| 11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 15L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8mm diameter probe |
| High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
| Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
| V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
| 250 mL isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
| Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
| Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
| Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
| Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
| Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 3mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
| Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
| Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
| Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
| 0.3cc insulin syringe with 29 g needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
| Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10X PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
| Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
| 60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| 27g winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
| 0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
| 4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
| ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
| Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |
Referências
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