Die Quantifizierung der neurovaskulären Schutz Nach Repetitive hypoxische Präkonditionierung und Transient mittleren Hirnarterie Occlusion in Mice
Summary
This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.
Abstract
Experimentellen Tiermodellen von Schlaganfall sind wertvolle Werkzeuge für das Verständnis Schlaganfall Pathologie und Entwicklung wirksamerer Behandlungsstrategien. A 2 Wochen Protokoll für sich wiederholende hypoxischen Präkonditionierung (RHP) induziert langfristigen Schutz gegen das zentrale Nervensystem (ZNS) verletzt in einem Mausmodell der fokalen ischämischen Schlaganfall. RHP besteht aus 9 stochastischen Belichtungen auf Hypoxie, die sowohl in der Zeitdauer (2 bzw. 4 h) und die Intensität (8% und 11% O 2) zu variieren. RHP reduziert Infarktvolumen, Blut-Hirn-Schranke (BHS) Störung, und die nach einem Schlaganfall entzündliche Reaktion für Wochen nach dem letzten Auftreten von Hypoxie, was auf eine langfristige Induktion einer endogenen ZNS-Schutz Phänotyp. Die Methodik für die Dual-Quantifizierung der Infarktvolumen und BBB Störung wirksam ist bei der Beurteilung der neurovaskulären Schutz bei Mäusen mit RHP oder andere vermeintliche Neuroprotektoren. Erwachsene männliche Swiss Webster-Mäuse wurden durch RHP oder Dauer-äquivalenten Belichtungen auf 21% O vorkonditioniert <sub> 2 (dh Raumluft). A 60 min transiente mittleren Hirnarterie (tMCAo) wurde 2 Wochen nach der letzten induzierten hypoxischen Exposition. Sowohl der Okklusion und Reperfusion wurden durch transkranielle Laser-Doppler-Flussmessung bestätigt. Zweiundzwanzig Stunden nach der Reperfusion, Evans Blue (EB) wurde intravenös durch eine Injektion in die Schwanzvene verabreicht. 2 Stunden später wurden die Tiere mit Isofluran Dosierung und Gehirnschnitte geopfert wurden mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) angefärbt. Infarkte Volumina wurden dann quantifiziert. Als nächstes wurde EB aus dem Gewebe über 48 Stunden extrahiert, um BBB-Störung nach tMCAo bestimmen. Zusammenfassend ist RHP ein einfaches Protokoll, repliziert werden kann, mit minimalen Kosten, um langfristige endogenen neurovaskulären Schutz vor Schlaganfall Verletzungen bei Mäusen zu induzieren, mit der Translationspotential anderen ZNS-basierte und systemische proinflammatorische Krankheitszuständen.
Introduction
Als die führende Ursache für Invalidität bei Erwachsenen und die vierte führende Ursache des Todes ist der Schlaganfall eine der am stärksten beeinträchtigenden Krankheitszuständen vor der erwachsenen Bevölkerung der Vereinigten Staaten. 1 Tiermodellen von Schlaganfall ermöglichen experimentelle Erforschung neuer Methoden zur Reduzierung ischämischer Verletzung und Verbesserung der post-Wiederherstellung nach Schlaganfall. Ein neuartiger Weg für solche translationale Forschung ist Präkonditionierung. Vorkonditionierung ist die vorsätzliche Verwendung eines nicht-schädigenden Stimulus, um Schäden durch eine nachfolgende, und schwerer, Verletzungen zu vermeiden. 2 hypoxische Präkonditionierung hat sich gezeigt, pleiotrope Veränderungen im Gehirn, die Schutz vor Schlaganfall in vivo und in vitro Studien in produzieren . 3 jedoch eine einzige Forderung zu Hypoxie bietet nur kurzfristige Neuroprotektion, induzieren weniger als 72 Stunden von Toleranz gegenüber Ischämie in erwachsenen Mäusen. 4 Auch nach vier Wochen 14 Stunden tägliche Exposition bis hypobaren Hypoxie, Lin et al. found dass die Neuroprotektion wurde nur für eine Woche. 5 Repetitive hypoxischen Präkonditionierung (RHP) aufrechterhalten wird durch stochastische Schwankungen der Häufigkeit, Dauer und Intensität der hypoxischen Exposition aus. Im Gegensatz zu einem einzigen Präkonditionierung Herausforderung, RHP induziert eine cerebroprotektive Phänotyp, für bis zu 8 Wochen bei Mäusen. 6 RHP reduzierte Infarktvolumen, Blut-Hirn-Schranke (BHS) Störungen, Gefäßentzündung, und Leukozyten Diapedese für Wochen nach der letzten hypoxischen Exposition . RHP spezifisch verringert Entzündungen im ischämischen Gehirn durch Reduzieren T-Zelle, Monozyt und Makrophage-Populationen, und gleichzeitig B-Zellpopulationen in der ischämischen Hemisphäre. 7 Tatsächlich induzierte RHP immunsuppressiv Phänotyp bei Mäusen vor einer ZNS-Verletzung, einschließlich Schlaganfall. RHP-behandelten B-Zellen aus RHP-behandelten gesunden Mäusen isoliert zeigte eine einzigartige entzündungshemmende Phänotyp, mit einer Herabregulation der beiden Antigen-Präsentation und Antikörperproduktion. DieGesamtreduzierung der proinflammatorischen adaptiven Immunmechanismen macht RHP eine hervorragende Methode, um die endogene Immunsuppression nicht nur für ZNS-spezifische Entzündungserkrankungen zu induzieren, aber auch systemische Verletzungen oder Krankheitsmodelle, die eine pro-inflammatorischen Pathologie gehören.
RHP reduziert sowohl Infarktvolumen und BBB Störung nach einer transienten mittleren Hirnarterie (tMCAo). Tiermodellen von Schlaganfall, wie die üblicherweise verwendeten tMCAo, dramatisch verbessern das Verständnis der Pathophysiologie von Schlaganfall, sowie die Gestaltung effektiver Neurotherapie. Zuerst von Koizumi et al., 1986, 8 die tMCAo Verfahren ein weit verbreitetes Verfahren zur Induzierung von Schlaganfall bei Nagern und eine der bevorzugten Methoden zur Untersuchung von Entzündungen nach Reperfusion. Da die Methoden zur tMCAo entwickeln, die neuere Verwendung von silikonbeschichteten Filamente weiter zu reduzieren das Risiko einer Subarachnoidalblutung Vergleich zu anderen Modellen 9,10 </ Sup> und die Zuverlässigkeit zu erhöhen, wenn auch leider tMCAo oft produziert eine breite Variation in der Infarktvolumen 11-13. Die meisten dieser Studien Abgrenzung Infarkt Regionen in koronalen Hirnschnitten durch Färbung mit 2,3,5- Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC), als Gold-Standard für die Quantifizierung der Infarkt, weil es ist eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, um lebendige, reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. TTC dient als Substrat in Mitochondrien Dehydrogenasen. Bei Gehirnschnitten sind dem TTC-Lösung ausgesetzt wird, wird TTC selektiv in lebende Zellen aufgenommen, wo ihre nichtlöslichen Reduktionsprodukt, Formazan- fällt auf eine tiefrote Farbe in lebensfähige Mitochondrien. Wegen mitochondriale Dysfunktion in der ischämischen Gewebe bleibt diese Gewebe weiß, so dass für die Differenzierung von beschädigten und gesundem Gewebe. 14
RHP reduziert auch BBB Störung in der ischämischen Hemisphäre. 6 daher den doppelten Quantifizierung BBB Integrität innerhalb der gleichen bRegenfälle als TTC-basierte Infarktvolumen Bestimmungen 15 würde nützliche Informationen über die volle Wirksamkeit der körpereigenen Schutz und mögliche kausale Beziehungen zwischen BBB Störung und Infarkt in unbehandelten und behandelten Tieren zu schaffen. Der Zustrom von peripheren Blut durch einen gestörten BBB, sekundäre Schlaganfall, erhöht Leukozyten-Populationen, proinflammatorische Zytokine, oxidativer Stress, vasogenen Ödeme und hämorrhagischen Transformation in der ischämischen Hemisphäre, letztlich die Erhöhung der Infektionsraten und Mortalität bei Patienten mit ischämischem Schlaganfall . 16,17 Ein übliches Verfahren zur Messung der BBB Störungen in Tiermodellen ist durch Quantifizierung von Evans-Blau (EB) Farbstoff Leck in das Gehirn. 15,18-21 EB selektiv an Albumin, eine globuläre Proteinserum (MW = 65 kDa) das bedeutet nicht die BBB nicht überqueren in unverletzten Tiere 22. Nach ischämischen Schlaganfall, infiltriert EB das Gehirn, und fluoresziert bei 620 nm, so dass für die Messung der optischen Dichte within perfundierten verletzt Parenchym. 22. Die optische Dichte ist direkt proportional zu der Permeabilität der BBB bei EB aus der Post-mortem kortikalen Vaskulatur von transcardiac Perfusion gewaschen. Mit der unmittelbaren Bearbeitung der TTC-gefärbten Gehirn bei Tieren mit EB Applikation können sowohl die Infarktvolumen und BBB Störung effektiv quantifiziert werden. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass neuronale Schädigung und BBB Störung nicht gleichzeitige Prozesse in der post stroke Gehirn, 23,24, so dass die Auswahl der Tötungszeitpunkt ist ein wichtiger Gesichtspunkt.
Das folgende Protokoll beschreibt die RHP-Methode, die tMCAo Verfahren zur Induktion einer vorübergehenden Arterienverschluss, dass Modelle mittleren Hirnarterie Verschlüssen bei menschlichen Patienten, und die Dual histologischen Methoden zur Bestimmung der neuronalen und vaskulären Schlaganfall Verletzungen Endpunkte. TTC misst Zelltod und kumulative Gewebeschädigung, so dass für die Quantifizierung eines Gesamtinfarkt volume, während EB sieht die hemisphärische Quantifizierung BBB Schäden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine einmalige Exposition, um systemische Hypoxie (dh 2 Stunden von 11% O 2) bei Mäusen "transient" schützt das Gehirn vor tMCAo, 29 bedeutet, die epigenetische Antwort auf die hypoxische Präkonditionierung Herausforderung ist von kurzer Dauer, und die Grundlinie Phänotyp innerhalb restauriert Tagen. Repetitive Präsentationen des hypoxischen Präkonditionierung Reiz dramatisch verlängern die Dauer der neuroprotektiven Phänotyp. 6 Viele Studien haben gezeigt, das…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Special thanks to the Gidday lab for their work in developing the RHP protocol, as well as the Neuro-Models Facility (UTSW) for their assistance in the tMCAo surgeries. This work was supported by grants from the American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS), and The Spastic Paralysis Research Foundation of the Illinois-Eastern Iowa District of Kiwanis International (JMG).
Materials
| Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
| 21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
| 11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 15L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8mm diameter probe |
| High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
| Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
| V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
| 250 mL isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
| Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
| Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
| Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
| Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
| Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 3mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
| Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
| Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
| Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
| 0.3cc insulin syringe with 29 g needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
| Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10X PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
| Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
| 60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| 27g winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
| 0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
| 4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
| ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
| Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |
Referências
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