Quantificação de Proteção Neurovascular sequência repetitiva Hypoxic Pré-condicionamento e Transient Oriente oclusão da artéria cerebral em ratos

Summary

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

Abstract

Modelos animais experimentais de acidente vascular cerebral são ferramentas inestimáveis ​​para a compreensão do AVC e desenvolvendo estratégias de tratamento mais eficazes. Um protocolo de 2 semanas para o pré-condicionamento repetitivo hipóxica (RHP) induz a proteção a longo prazo contra a lesão do sistema nervoso central (SNC) em um rato modelo de acidente vascular cerebral isquêmico focal. RHP consiste em 9 exposições estocásticos a hipoxia, que variam em termos de duração (2 ou 4 h) e intensidade (8% e 11% de O _2). RHP reduz os volumes de enfarte, barreira sangue-cérebro (BBB) ​​uma ruptura, e a resposta inflamatória pós-derrame durante semanas após a última exposição a hipoxia, sugerindo uma indução de longo prazo de um fenótipo do SNC de protecção endógena. A metodologia para a quantificação dual de volume do enfarte e a certificação perturbação é eficaz na avaliação da protecção neurovascular em ratinhos com RHP ou outros neuroprotectores putativos. Camundongos adultos machos Swiss Webster foram pré-condicionados por RHP ou exposições de duração equivalente a 21% de O <sub> 2 (ou seja, sala de ar). A oclusão da artéria 60 min transitória cerebral média (tMCAO) foi induzida duas semanas após a última exposição hipóxica. Tanto a oclusão e reperfusão foram confirmados por transcraniana dopplerfluxometria a laser. Vinte e duas horas após a reperfusão, Azul de Evans (EB) foi administrado por via intravenosa através de uma injecção na veia da cauda. 2 horas mais tarde, os animais foram sacrificados por overdose e secções do cérebro foram corados com isoflurano 2,3,5- cloreto de trifeniltetrazólio (TTC). Os volumes de enfarte foram então quantificadas. Em seguida, EB foi extraído do tecido ao longo de 48 horas para determinar BBB interrupção após tMCAO. Em resumo, RHP é um protocolo simples, que pode ser replicado, com um custo mínimo, para induzir protecção endógena neurovascular a longo prazo de uma lesão acidente vascular cerebral em ratos, com o potencial de translação para outros estados de doença pró-inflamatórias baseados em CNS e sistémicas.

Introduction

Como a principal causa de incapacidade em adultos e a quarta principal causa de morte, acidente vascular cerebral é um dos estados patológicos mais debilitantes que afectam a população adulta dos Estados Unidos. ¹ Os modelos animais de acidente vascular cerebral permitir a investigação experimental de novos métodos de reduzir a lesão isquémica e melhorar a recuperação pós-acidente vascular cerebral. Uma nova avenida para tal investigação translacional é pré-condicionamento. Pré-condicionamento é o uso intencional de um estímulo não prejudicial para reduzir a lesão a partir de uma subsequente e mais grave, ferimento. ² o pré-condicionamento hipóxica foi mostrado para produzir alterações pleiotrópicos no cérebro que fornecem protecção contra derrame em tanto in vivo e in vitro . ³ No entanto, uma única exposição à hipóxia só oferece neuroproteção de curto prazo, induzindo menos de 72 horas de tolerância contra a isquemia em ratos adultos. ⁴ Mesmo depois de quatro semanas de 14 horas exposição diária à hipóxia hipobárica, Lin et al. found neuroproteção que só foi sustentado por uma semana. ⁵ hipóxico pré-condicionamento repetitivo (RHP) é caracterizada por variações estocásticos em frequência, duração e intensidade da exposição hipóxia. Em contraste com um desafio único de pré-condicionamento, RHP induz um fenótipo cerebroprotective que dura até oito semanas em ratinhos. ⁶ RHP redução dos volumes de enfarte, barreira sangue-cérebro (BBB) ​​uma ruptura, inflamação vascular, e a diapedese de leucócitos para semanas após a última exposição hipóxica . RHP especificamente redução da inflamação no cérebro isquémico por redução de células T, monócitos, e populações de macrófagos, mantendo ao mesmo tempo as populações de células B no hemisfério isquémico. ⁷ Na verdade, RHP induziu um fenótipo imunossupressora em ratos antes de qualquer lesão do SNC, incluindo acidente vascular cerebral. As células B tratadas com RHP isolados a partir de ratos saudáveis ​​tratados com RHP exibiram um fenótipo anti-inflamatório único, com uma regulação negativa tanto de apresentação de antigénio e produção de anticorpos. Oredução global nos mecanismos imunes adaptativas pró-inflamatórios faz RHP uma excelente metodologia para induzir imunossupressão endógena para não só as doenças inflamatórias do SNC-específicos, mas também lesões ou doenças sistémicas modelos que incluem uma patologia pró-inflamatória.

RHP reduz tanto o volume de enfarte e certificação interrupção na sequência de uma oclusão transiente da artéria cerebral média (tMCAO). Os modelos animais de acidente vascular cerebral, tais como a tMCAO comumente usados, melhorar dramaticamente a compreensão da patofisiologia de acidente vascular cerebral, bem como a concepção de Neurotherapeutics mais eficazes. Primeiro desenvolvido por Koizumi et al., Em 1986, o procedimento tMCAO ⁸ é um método amplamente utilizado de induzir acidente vascular cerebral em roedores e um dos métodos preferidos para a investigação de inflamação após a reperfusão. Como os métodos para tMCAO evoluir, o uso mais recente de filamentos revestidos com silicone reduzir ainda mais o risco de hemorragia subaracnóide em comparação com outros modelos ^{9,10 <}/ Sup> e melhorar a confiabilidade, embora, infelizmente tMCAO muitas vezes produz uma grande variação de volumes de infarto. ^11-13 A maioria desses estudos delinear regiões infarto em seções cerebrais coronais por coloração com cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio (TTC), considerado um padrão-ouro para infarto quantificação, pois é uma maneira simples e barata de produzir resultados reproduzíveis vivas. TTC serve como um substrato de desidrogenases presentes na mitocôndria. Quando fatias de cérebro são expostos à solução de TTC, TTC é tomado selectivamente em células vivas, onde o seu produto de redução não-solúvel, formazano, precipita-se para uma cor vermelho escuro em mitocôndrias viáveis. Por causa da disfunção mitocondrial no tecido isquémico, este tecido permanece branco, permitindo a diferenciação do tecido danificado e saudável. ¹⁴

RHP também reduz a certificação perturbação no hemisfério isquêmico. ⁶ Portanto, a dupla quantificação da integridade BBB dentro da mesma bchuvas como o volume de enfarte baseada em TTC ¹⁵ determinações iria fornecer informações úteis sobre a eficácia plena da protecção endógena, e as relações causais entre potenciais BBB perturbações e infarto em animais tratados e não tratados. O afluxo de sangue periférico através de uma certificação interrompido, secundária a acidente vascular cerebral, aumenta populações de leucócitos, citocinas pró-inflamatórias, estresse oxidativo, edema vasogênico e transformação hemorrágica no hemisfério isquêmico, finalmente, aumentar as taxas de infecção e mortalidade em pacientes com acidente vascular cerebral isquêmico ^16,17. Um método comum de medir a certificação ruptura em modelos animais é através de quantificação de azul de Evans (EB) vazamento de corante no cérebro. ^15,18-21 EB liga-se selectivamente a albumina do soro, uma proteína globular (PM = 65 kDa) que não atravessa a certificação em animais não lesionados. ²² Seguindo acidente vascular cerebral isquémico, EB se infiltra no cérebro, e fluoresce a 620 nm, permitindo a medição da densidade óptica within o parênquima ferido perfundidos. ²² A densidade óptica é directamente proporcional à permeabilidade da BHE quando EB foi lavada para fora da vasculatura cortical post mortem por perfusão transcardíaca. Com o processamento imediato dos cérebros TTC-corada em animais com a administração EB, tanto o volume do enfarte e a certificação perturbação pode ser quantificada de forma eficaz. Deve notar-se, no entanto, que a lesão neuronal e a certificação perturbação não são processos concomitantes no cérebro pós-AVC, ^23,24 de modo que a selecção de tempo de sacrifício é uma consideração importante.

O protocolo que se segue detalha a RHP método, o método tMCAO para induzir uma oclusão arterial temporária que modela oclusões da artéria cerebral média em pacientes humanos, os métodos histológicos e para a determinação dupla neuronais e vasculares terminais lesão do derrame. TTC mede a morte celular e danos nos tecidos cumulativo, o que permite a quantificação de um enfarte vol globalume, enquanto EB prevê a quantificação dos danos hemisférica BBB.

Protocol

NOTA: Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC) da UT Southwestern Medical Center, que age de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde política (NIH) para uso animal experimental. 1. Pré-condicionamento repetitivo Hypoxic Projete quatro medidores de vazão em reguladores de gás e anexar a câmaras de indução 15 L padrão com tubos de PVC para permitir que o gás comprimido a partir do oxigênio (O 2) tanques a flu…

Representative Results

Este estudo incluiu 25 ratinhos Swiss Webster machos que tinham 10 semanas de idade no início da randomização em RHP (n = 10) ou 21% de O 2 (n = 15) grupos. Duas semanas após a exposição final RHP, procedimentos cirúrgicos foram realizados, com grupos cegos e contrabalançadas entre os dias. Seguindo tMCAO, um rato morreu durante a recuperação pós-operatória e um rato foi excluído do estudo porque não cumpria o critério de reperfusão CBF. Ambos os ratos foram excluídos do grupo O <s…

Discussion

Uma única exposição à hipóxia sistêmica (ou seja, 2 horas de 11% O ₂₎ em camundongos "transitoriamente" protege o cérebro de tMCAO, ²⁹ ou seja, a resposta epigenética ao desafio hipóxico pré-condicionamento é de curta duração, eo fenótipo linha de base é restaurada dentro dias. Apresentações repetitiva do estímulo pré-condicionamento hipóxico alargar drasticamente a duração do fenótipo neuroprotector. ⁶ Muitos estudos têm demonstrado que a frequ…

Materials

Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Flowmeters, regulators	VetEquip, Inc	Specialty order	Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench.
21% O2 tank	AirGas	OX USP200
11% O2 tank	AirGas	Specialty order
8% O2 tank	AirGas	Specialty order
15L induction chambers	VetEquip	941454
Moor Laber Dopper Flow	Moor Instruments	moorVMS-LDF1-HP	0.8mm diameter probe
High Intensity Illuminator	Nikon	NI-150
Zoom Stereo Microscope	NIkon	SMZ800	Other surgical microscopes may be used.
Kent Scientific Right Temperature CODA	Kent Scientific Corporation	Discontinued	Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT).
Hovabator Incubator	Stromberg's	2362-E	Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat.
V010 Anesthesia system	VetEquip	901807	Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters
250 mL isoflurane	Butler Schein	NDC-11695
D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer	Andis	#23905	Replacement blades are available from Andis (#23995)
Betadine	Fisher Scientific	19-898-867
Q-tips	Multiple sellers	Catalog number not available
Gauze Pads	Fisher Scientific	67622
Surgical drape	Fisher Scientific	GM300
Silk Sutures	Look/Div Surgical Specialties	SP115
Nylon Sutures	Look/Div Surgical Specialties	SP185
Durmont #5 forceps (2)	Fine Science Tools	11251-35	Angled 45°
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14028-10
3mm Vannas	Kent Scientific Corporation	INS600177	Straight blade
Hartman Hemostats	Fine Scientific Tools	13002-10
Occluding filaments	Washington University	Specialty order	Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee.
Evans Blue	Sigma Aldritch	E2129-10G
Filter Paper	Sigma Aldritch	WHA1001150	150 mm, circles, Grade 1
Weigh Boats	Fisher Scientific	02-202-101	2.5" diameter
0.9% Sodium Chloride Injection USP	Baxter Pharmaceutics	2B1321
0.3cc insulin syringe with 29 g needle	Becton Dickinson Labware	309301
Flat bottom restrainer	Braintree Scientific	FB M	2.0" diameter
TTC	Sigma	T8877
10X PBS, pH 7.4	Fisher Scientific	BP399-20
Water Bath	Multiple sellers	Catalog number not available	Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath.
Styrofoam board	Multiple sellers	Catalog number not available
Large Syringe Kit	PumpSystems Inc	P-SYRKIT-LG
Perfusion Pump	PumpSystems Inc	NE-300
60 cc syringe	Fisher Scientific	NC9203256
27g winged infusion set	Kawasumi Laboratories, Inc	D3K1-25G 1
20 ml scintillation vial	Fisher Scientific	50-367-126
Stainless steel spatula	Fisher Scientific	14-373-25A
Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal	CellPoint Scientific	Catalog number not available
0.21 mm stainless steel blades, 25 pk	CellPoint Scientific	Catalog number not available	Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative.
4% paraformaldehyde	Santa Cruz Biotechnology	SC-281692
Superfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
HP Scanjet G4050	Multiple sellers	Catalog number not available	Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol.
ImageJ	National Institute of Health	Catalog number not available
Analytical Balance	Mettler Toledo	XSE 205U
Precision Compact Oven	Thermo Scientific	PR305225M
1.7 mL microcentrifuge tubes (Eppendorfs)	Denville Scientific	C2170
Formamide	Fisher Scientific	BP228-100
96-well plates	Fisher Scientific	07-200-9
Epoch Microplate Spectrophotometer	BioTek	Catalog number not available