This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.
Экспериментальные модели на животных инсульта являются бесценными инструментами для понимания хода патологии и разработке более эффективных стратегий лечения. 2 недели протокол для повторного гипоксического прекондиционирования (RHP) индуцирует долговременную защиту против центральной нервной системы (ЦНС) травмы в мышиной модели координационного ишемического инсульта. ПРЗ состоит из 9 стохастических воздействий к гипоксии, которые изменяются в обоих длительности (2 или 4 ч) и интенсивности (8% и 11% O 2). ПРЗ уменьшает объемы инфаркта, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) нарушения, и постинсультной воспалительную реакцию в течение недель после последнего воздействия гипоксии, предлагая долгосрочные индукции эндогенного ЦНС защитного фенотипа. Методология двойной количественного объема инфаркта и нарушения BBB является эффективным при оценке нервно-сосудистого защиту у мышей с ПРЗ или других предполагаемых нейропротекторами. Взрослых самцов мышей Swiss Webster были обусловлена ПРЗ или продолжительность эквивалент воздействия до 21% O <suB> 2 (т.е. воздуха в помещении). 60 мин временной окклюзии средней мозговой артерии (tMCAo) индуцировали 2 недели после последней гипоксии. Оба окклюзии и реперфузии были подтверждены транскраниальной лазерной доплеровской флоуметрии. Двадцать два часа после реперфузии, Эванс синий (EB) вводили внутривенно через инъекции в хвостовую вену. 2 ч позже, животные были принесены в жертву изофлурановой передозировки и срезах мозга окрашивали 2,3,5- трифенилтетразолинхлорида хлорида (TTC). Инфаркты объемы затем количественно. Далее, ЕВ экстрагировали из ткани более 48 ч, чтобы определить разрушение ВВВ после tMCAo. В целом, RHP является простой протокол, который может быть воспроизведен, с минимальными затратами, чтобы вызвать долгосрочное эндогенного сосудисто-нервный защиту от травм инсульта у мышей, с поступательным потенциала для других ЦНС на основе системных и провоспалительных болезненных состояний.
Как ведущий дело взрослых инвалидности и четвертой ведущей причиной смерти, инсульта является одним из самых изнурительных болезненных состояний, стоящих перед взрослое население Соединенных Штатов. 1 животных моделях инсульта позволяют экспериментального исследования новых методов снижения ишемического повреждения и улучшение восстановление после инсульта. Один роман проспект для такого поступательного исследования предварительной подготовки. Предварительная это умышленное использование безвредных стимулов для снижения ущерба от последующего, более тяжелой, травмы. 2 гипоксического прекондиционирования было показано, чтобы произвести плейотропные изменения в головном мозге, которые обеспечивают защиту от инсульта в как в естественных условиях и в пробирке исследования . 3 Тем не менее, при однократном воздействии гипоксии предлагает только краткосрочную нейропротекцию, вызывая меньше 72 ч толерантности в отношении ишемии у взрослых мышей. 4 Даже после четырех недель 14 ч ежедневно воздействия на гипобарической гипоксии, Лин и др. FOунд что нейропротекция лишь поддерживается в течение одной недели. 5 повторяющихся гипоксического прекондиционирования (RHP) характеризуется стохастических изменений в частоте, продолжительности и интенсивности гипоксических воздействий. В отличие от одного вызова предварительной подготовки, ПРЗ индуцирует церебропротективное фенотип, который длится до восьми недель у мышей. 6 ПРЗ сократили объемы инфаркта, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), нарушения сосудистого воспаления, и лейкоцитов диапедез неделями после окончательного гипоксии , RHP частности уменьшается воспаление в ишемической мозга за счет снижения Т-клеток, моноцитов, макрофагов и популяции, сохраняя популяции В-клеток в ишемической полушарии. 7 В самом деле, RHP индуцированной иммунодепрессивное фенотип у мышей до любого повреждения ЦНС, в том числе инсульта. ПРЗ обработанные В-клетки, выделенные из ПРЗ обработанной здоровых мышей выставлены уникальные противовоспалительное фенотип, с подавлением как презентации антигена и продукции антител.общее снижение провоспалительных адаптивных иммунных механизмов делает ПРЗ отличную методику, чтобы вызвать эндогенный иммунитета не только для ЦНС конкретных воспалительных заболеваний, но и системные травмы или болезни, которые включают модели про-воспалительной патологии.
ПРЗ снижает как объем инфаркта и нарушения ВВВ следующий переходного окклюзии средней мозговой артерии (tMCAo). Животные модели инсульта, такие как обычно используемые tMCAo, значительно улучшить понимание патофизиологии инсульта, а также разработку более эффективных neurotherapeutics. Во-первых, разработанная Коидзуми и др., В 1986 году, 8 процедура tMCAo это широко используемый метод индукции инсульта у грызунов и одним из предпочтительных методов исследования воспаление после реперфузии. В качестве способов tMCAo развиваться, более недавнее использование силиконовых покрытием волокон дополнительно снизить риск субарахноидального кровоизлияния по сравнению с другими моделями 9,10 </ SUP> и повышения надежности, хотя, к сожалению, часто tMCAo производит широкий разброс в объемах инфаркта. 11-13 Большинство из этих исследований разграничить миокарда регионы корональных срезах мозга с помощью окрашивания 2,3,5- трифенилтетразолинхлорида хлорида (TTC), считается золотой стандарт для количественного инфаркта, потому что это простой и недорогой способ позволяет получать яркие, воспроизводимых результатов. TTC служит субстратом дегидрогеназ, присутствующих в митохондриях. При срезах мозга подвергаются раствора TTC, TTC избирательно принимать во живых клеток, где его нерастворимые продукт восстановления, формазана, выпадает в осадок в глубокий красный цвет в жизнеспособных митохондрий. Из-за дисфункции митохондрий в ишемической ткани, эта ткань остается белым, что позволяет дифференциации поврежденной и здоровой ткани. 14
ПРЗ также уменьшает ВВВ нарушения в ишемической полушарии. 6 Таким образом, двойное количественное целостности BBB в той же бДожди, как ТТК основе объема инфаркта определений 15 будет предоставлять полезную информацию о полной эффективности эндогенного защиты, и потенциальные причинно-следственных связей между BBB нарушения и миокарда в необработанных и обработанных животных. Приток периферической крови через нарушается BBB, вторичной по отношению к инсульту, увеличивает популяции лейкоцитов, провоспалительных цитокинов, оксидативный стресс, Вазогенный отек и геморрагической трансформации в ишемической полушарии, в конечном счете, повышения ставок инфекции и смертности у пациентов с ишемическим инсультом . 16,17 распространенным методом измерения нарушения ВВВ на животных моделях через количественного Эванс синий (EB) утечки красителя в мозг. 15,18-21 EB селективно связывается с сывороточным альбумином, шаровидную белок (молекулярная масса = 65 кДа) что не проникает через ГЭБ в неповрежденных животных. 22 После ишемического инсульта, Е.Б. инфильтраты мозг, и флуоресцирует при 620 нм, что позволяет для измерения плотности оптического withiп перфузии паренхимы ранения. 22 Оптическая плотность прямо пропорциональна проницаемости ГЭБ при ЕВ была вымываются из посмертного коркового сосудистой путем transcardiac перфузии. С непосредственной обработки TTC-окрашенных мозга у животных с администрацией Б., как объем инфаркта и нарушение BBB может быть эффективно количественно. Следует отметить, однако, что повреждение нейронов и нарушение BBB не сопутствующие процессы в постинсультной мозга, 23,24, так выбор время умерщвления является важным фактором.
Протокол, который следует подробно метод RHP, метод tMCAo для индукции временного артериальной окклюзии, что модели среднего окклюзии мозговой артерии у больных человека, и двойные гистологические методы определения нейронных и сосудистые конечные точки травмы инсульт. ТТК измеряет гибель клеток и повреждение тканей совокупный, что позволяет для количественного определения общего инфаркта обрычажок, а EB обеспечивает полушария количественного BBB повреждений.
Одноразовое воздействие системной гипоксии (то есть, 2 ч 11% O 2) у мышей "временно" защищает мозг от tMCAo, 29 означает эпигенетические ответ на вызов гипоксического прекондиционирования является кратковременным, и базовый фенотип восстанавливается в течение дней. Повт…
The authors have nothing to disclose.
Special thanks to the Gidday lab for their work in developing the RHP protocol, as well as the Neuro-Models Facility (UTSW) for their assistance in the tMCAo surgeries. This work was supported by grants from the American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS), and The Spastic Paralysis Research Foundation of the Illinois-Eastern Iowa District of Kiwanis International (JMG).
Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
15L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8mm diameter probe |
High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
250 mL isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
3mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
0.3cc insulin syringe with 29 g needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
TTC | Sigma | T8877 | |
10X PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
27g winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
1.7 mL microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |