Cuantificación de Protección neurovascular Siguiendo repetitivo hipóxico Precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones
Summary
This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.
Abstract
Modelos animales experimentales de ictus son herramientas muy valiosas para la comprensión de la patología de carrera y el desarrollo de estrategias de tratamiento más eficaces. Un protocolo de 2 semanas para precondicionamiento hipóxico repetitivo (RHP) induce una protección a largo plazo contra las lesiones del sistema nervioso central (SNC) en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular isquémico focal. RHP consta de 9 exposiciones estocásticos a la hipoxia que varían tanto en duración (2 o 4 hr) y la intensidad (8% y 11% O 2). RHP reduce los volúmenes de infarto, barrera hematoencefálica (BBB) perturbación, y la respuesta inflamatoria posterior al accidente cerebrovascular durante semanas después de la última exposición a la hipoxia, lo que sugiere una inducción a largo plazo de un fenotipo SNC-protectora endógena. La metodología para la cuantificación de doble el volumen del infarto y disrupción de la BHE es eficaz en la evaluación de la protección neurovascular en ratones con RHP u otros neuroprotectores putativos. Adultos ratones macho Swiss Webster fueron acondicionados previamente por RHP o exposiciones de duración equivalente al 21% de O <sub> 2 (es decir, aire ambiente). Una oclusión media transitoria 60 min arteria cerebral (tMCAo) fue inducida 2 semanas después de la última exposición hipóxica. Tanto la oclusión y reperfusión fueron confirmados por transcraneal flujometría Doppler láser. Veintidós horas después de la reperfusión, azul de Evans (EB) se administró por vía intravenosa a través de una inyección en la vena de la cola. 2 horas más tarde, los animales fueron sacrificados por sobredosis y secciones cerebrales isoflurano se tiñeron con cloruro de 2,3,5- trifeniltetrazolio (TTC). Los volúmenes de infarto fueron luego cuantificados. A continuación, EB se extrajo a partir del tejido durante 48 hr para determinar disrupción de la BHE después de tMCAo. En resumen, RHP es un protocolo simple que puede ser replicado, con un costo mínimo, para inducir protección neurovascular endógeno a largo plazo de una lesión derrame cerebral en ratones, con el potencial de la traducción de otros estados de enfermedad pro-inflamatorias CNS-basados y sistémicos.
Introduction
Como la principal causa de discapacidad en los adultos y la cuarta causa principal de muerte, accidente cerebrovascular es uno de los estados de enfermedad más debilitantes que enfrenta la población adulta de los Estados Unidos. 1 Los modelos animales de accidente cerebrovascular permiten para la investigación experimental de nuevos métodos de reducción de la lesión isquémica y mejorar la recuperación después de un accidente cerebrovascular. Una vía novedosa para este tipo de investigación traslacional se preacondicionamiento. Preacondicionamiento es el uso intencional de un estímulo no perjudicial para reducir el daño de una posterior, y más grave, lesiones. 2 hipóxico preacondicionamiento se ha demostrado que producen cambios pleiotrópicos en el cerebro que proporcionan protección contra el accidente cerebrovascular en tanto in vivo e in vitro . 3 Sin embargo, una sola exposición a la hipoxia sólo ofrece neuroprotección corto plazo, lo que induce a menos de 72 horas de la tolerancia frente a la isquemia en ratones adultos. 4 incluso después de cuatro semanas de exposiciones diarias 14 hr a la hipoxia hipobárica, Lin et al. found neuroprotección que solamente se mantuvo durante una semana. 5 precondicionamiento hipóxico repetitiva (RHP) se caracteriza por las variaciones estocásticas en la frecuencia, duración e intensidad de las exposiciones hipóxicas. En contraste con un único reto preacondicionamiento, RHP induce un fenotipo cerebroprotectora que dura hasta ocho semanas en ratones. 6 RHP redujo los volúmenes de infarto, barrera hematoencefálica (BBB) perturbación, inflamación vascular y diapedesis de leucocitos durante semanas después de la exposición hipóxica definitiva . RHP reduce específicamente la inflamación en el cerebro isquémico mediante la reducción de las células T, monocitos, macrófagos y las poblaciones, mientras que el mantenimiento de las poblaciones de células B en el hemisferio isquémico. 7 De hecho, RHP induce un fenotipo inmunosupresor en ratones antes de cualquier lesión del SNC, incluido el accidente cerebrovascular. Células B tratados con RHP aisladas de ratones sanos tratados-RHP exhibieron un fenotipo antiinflamatorio único, con una regulación a la baja tanto de la presentación de antígenos y la producción de anticuerpos. Losreducción general en mecanismos inmunes adaptativos pro-inflamatorias hace RHP una excelente metodología para inducir inmunosupresión endógena no sólo para enfermedades inflamatorias del SNC-específicos, sino también modelos de lesión o enfermedad sistémica que incluyen una patología pro-inflamatorio.
RHP reduce tanto el volumen del infarto y la disrupción de la BHE tras una oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAo). Los modelos animales de accidente cerebrovascular, tales como el comúnmente usado tMCAo, mejorar dramáticamente la comprensión de la fisiopatología del accidente cerebrovascular, así como el diseño de Neurotherapeutics más eficaces. Primero desarrollado por Koizumi et al., En 1986, el procedimiento tMCAo 8 es un método ampliamente utilizado de inducir accidente cerebrovascular en roedores y uno de los métodos preferidos para la investigación de la inflamación después de la reperfusión. Como los métodos para tMCAo evolucionan, el uso más reciente de filamentos recubiertos de silicona reducir aún más el riesgo de hemorragia subaracnoidea en comparación con otros modelos de 9,10 </ Sup> y mejorar la fiabilidad, aunque por desgracia tMCAo menudo produce una amplia variación en los volúmenes de infarto. 11-13 La mayor parte de estos estudios delinear regiones de infarto en el cerebro secciones coronales mediante tinción con cloruro de 2,3,5- trifeniltetrazolio (TTC), considerado un estándar de oro para la cuantificación del infarto debido a que es una manera simple y barata de producir vivos, resultados replicables. TTC sirve como un sustrato de deshidrogenasas presentes en las mitocondrias. Cuando rodajas de cerebro están expuestos a la solución de TTC, TTC se toma selectivamente en células vivas donde su producto de reducción no soluble, formazán, precipita a un color rojo intenso en la mitocondria viables. Debido a la disfunción mitocondrial en el tejido isquémico, este tejido permanece blanco, lo que permite la diferenciación del tejido dañado y sano. 14
RHP también reduce la acreditación interrupción en el hemisferio isquémico. 6 Por lo tanto, la doble cuantificación de acreditación integridad dentro de la misma blluvias como el volumen del infarto basado en TTC Determinaciones 15 proporcionaría información útil sobre la eficacia plena de la protección endógena, y posibles relaciones causales entre la disrupción de la BHE y el infarto en los animales no tratados y tratados. La afluencia de sangre periférica a través de una acreditación interrumpido, secundaria a un accidente cerebrovascular, aumenta poblaciones de leucocitos, citoquinas pro-inflamatorias, estrés oxidativo, edema vasogénico y transformación hemorrágica en el hemisferio isquémico, en última instancia, el aumento de las tasas de infección y mortalidad en pacientes con ictus isquémico 16,17. Un método común de medir la disrupción de la BHE en modelos animales es a través de la cuantificación de azul de Evans (EB) de fugas de tinte en el cerebro. 15,18-21 EB se une selectivamente a la albúmina sérica, una proteína globular (MW = 65 kDa) que no atraviesa la BBB en animales no lesionados. 22 Tras el accidente cerebrovascular isquémico, EB se infiltra en el cerebro, y emite fluorescencia a 620 nm, lo que permite la medición de la densidad óptica within el parénquima lesionado perfundido. 22 La densidad óptica es directamente proporcional a la permeabilidad de la BBB cuando EB ha sido lavada fuera de la vasculatura cortical post-mortem por perfusión transcardiaca. Con el procesamiento inmediato de los cerebros teñidas con TTC en animales con administración EB, tanto el volumen del infarto y la disrupción de la BHE se pueden cuantificar de manera efectiva. Cabe señalar, sin embargo, que el daño neuronal y la disrupción de la BHE no son procesos concomitantes en el cerebro post-accidente cerebrovascular, 23,24 lo que la selección de tiempo de sacrificio es una consideración importante.
El protocolo que sigue detalla el método RHP, el método tMCAo para inducir una oclusión arterial temporal que los modelos de las oclusiones de la arteria cerebral media en pacientes humanos, y los métodos histológicos duales para determinar neurales y vasculares puntos finales de lesiones accidente cerebrovascular. TTC mide la muerte celular y el daño tisular acumulativa, lo que permite la cuantificación de un infarto vol generalume, mientras que EB ofrece para la cuantificación hemisférica de acreditación daños.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una sola exposición a la hipoxia sistémica (es decir, 2 hr de 11% O 2) en ratones protege "transitoriamente" el cerebro de tMCAo, 29 es decir, la respuesta epigenética al desafío de preacondicionamiento hipóxica es de corta duración, y el fenotipo de la línea de base se restablece dentro de día. Presentaciones repetitivo del estímulo hipóxico preacondicionamiento se extienden dramáticamente la duración del fenotipo neuroprotector. 6 Muchos estudios han demo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Special thanks to the Gidday lab for their work in developing the RHP protocol, as well as the Neuro-Models Facility (UTSW) for their assistance in the tMCAo surgeries. This work was supported by grants from the American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS), and The Spastic Paralysis Research Foundation of the Illinois-Eastern Iowa District of Kiwanis International (JMG).
Materials
| Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
| 21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
| 11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 15L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8mm diameter probe |
| High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
| Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
| V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
| 250 mL isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
| Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
| Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
| Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
| Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
| Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 3mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
| Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
| Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
| Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
| 0.3cc insulin syringe with 29 g needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
| Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10X PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
| Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
| 60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| 27g winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
| 0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
| 4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
| ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
| Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |
Referências
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