This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.
Inme deneysel hayvan modelleri inme patoloji anlamak ve daha etkin tedavi stratejileri geliştirmek için paha biçilmez araçlardır. Tekrarlayan hipoksik önkoşullama (TÜSP) A 2 hafta protokol fokal iskemik inme bir fare modelinde merkezi sinir sistemi (MSS) yaralanmalara karşı uzun süreli koruma uyarır. ÜSP hem süresi (2 ya da 4 saat) ve yoğunluğu (% 8 ve% 11 O2) değişir hipoksiye 9 stokastik maruz oluşur. ÜSP endojen bir merkezi sinir sistemi koruyucu fenotipin uzun süreli indükleme gösteren, infarkt hacmi, kan-beyin bariyeri (BBB) kesintileri ve hipoksi son maruz kaldıktan sonra hafta inme sonrası inflamatuar yanıtı azalır. infarkt hacmi BBB bozulması çift ölçümü için yöntem ÜSP ya da diğer olası nöro-koruyucu olan farelerde nörovasküler koruma değerlendirilmesinde etkindir. Yetişkin erkek Swiss Webster fareleri% 21 O kadar ÜSP veya süresi eşdeğer maruz kalma tarafından öngörülmekte edildi <sub> 2 (yani oda havası). 60 dk geçici orta serebral arter tıkanıklığı (tMCAo) Son hipoksik maruziyet aşağıdaki 2 hafta oluşturuldu. Oklüzyon ve reperfüzyon Hem transkraniyal lazer Doppler flowmetre ile doğrulanmıştır. Reperfüzyondan sonra yirmi iki saat Evans Mavi (EB) damardan, bir kuyruk damarından enjeksiyon yoluyla uygulanmıştır. 2 saat sonra, hayvanlar izofluran doz aşımı ve beyin kesitleri ile kurban edilmiş 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür (TTC) ile boyandı. İnfarktlar hacimleri daha sonra sayıldı. Daha sonra, EB tMCAo sonra BBB bozulma belirlemek için 48 saat boyunca dokusundan ekstre edilmiştir. Özet olarak, ÜSP diğer merkezi sinir sistemi tabanlı ve sistemik pro-enflamatuar hastalık durumları için translasyon potansiyeli olan farelerde, felç yaralanması uzun vadeli endojen nörovasküler koruma indükleme, minimum maliyet, çoğaltılmış basit bir protokoldür.
Yetişkin sakatlık ve ölüm dördüncü önde gelen nedeni önde gelen nedeni olarak, inme ABD yetişkin nüfusun karşı karşıya olduğu en zayıflatıcı hastalık devletlerinden biridir. Inme 1 hayvan modelleri iskemik yaralanma azaltarak yeni yöntemler ve deneysel araştırma için izin İnme sonrası kurtarma iyileştirilmesi. Böyle translasyonel araştırma için bir yeni cadde ön hazırlık olduğunu. Önkoşullanma takip eden ve daha ciddi yaralanma zararı azaltmak için olmayan bir zarar uyaran kasıtlı kullanımıdır. 2 Hipoksik önkoşullanma in vivo ve in vitro çalışmalar, hem de vuruş karşı koruma sağlayan beyinde pleiotropik değişikliklere gösterilmiştir . 3 Bununla birlikte, hipoksi bir tek maruziyet sadece erişkin farelerde iskemiye karşı toleransı az 72 saat uyaran, kısa vadeli nöro sunmaktadır. Lin ve ark hipobarik hipoksi 14 saat, günlük risklerin 4 Hatta dört hafta sonra. found o nöro sadece bir hafta. 5 Tekrarlanan hipoksik önkoşullama (TÜSP) için devam etti sıklığı, süresi ve hipoksik risklerin yoğunluk stokastik varyasyonlar ile karakterizedir. Tek bir önkoşullanma meydan aksine, TÜSP farelerde sekiz hafta kadar süren bir serebroprotektiftir fenotip oluşturmakta. 6 RHP son hipoksi maruz kaldıktan sonra hafta boyunca enfarktüs hacimleri, kan-beyin bariyeri (KBB) bozulması, damar iltihabı ve lökosit ROS azaltılmış . ÜSP özellikle işemik hemisferde B hücresi popülasyonlarının korurken, T hücresi, monosit ve makrofaj popülasyonlarının düşürülmesinde iskemik beyin iltihabı, indirgenmiş. 7 Aslında, ÜSP felç dahil olmak üzere, herhangi bir merkezi sinir sistemi hasarı önce farelerde bir bağışıklık bastırıcı fenotipi neden olmuştur. ÜSP ile tedavi edilen sağlıklı farelerden izole ÜSP ile muamele edilmiş B hücreleri, antijen sunumu ve antikor üretimi hem de bir baskılanması ile, özel bir anti-inflamatuar bir fenotip sergilemiştir.pro-enflamatuar adaptif immün mekanizmaları genel azalma sadece merkezi sinir sistemi özgü enflamatuar hastalıklar için endojen bağışıklık indükleme ÜSP mükemmel bir yöntem sağlar, aynı zamanda, bir ön-iltihabik nedenleri mevcuttur sistemik yaralanma ya da hastalık modelleri.
TÜSP geçici orta serebral arter tıkanıklığı (tMCAo) Aşağıdaki infarkt hacmi ve BBB bozulma azaltır. Gibi yaygın olarak kullanılan tMCAo inme hayvan modelleri, çarpıcı bir şekilde inme olduğunun anlaşılması, yanı sıra, daha etkili nöroterapötik tasarımını geliştirmek. İlk Koizumi ve arkadaşları tarafından geliştirilen. 1986 yılında, 8 tMCAo prosedürü kemirgenlerde inme ve reperfüzyon aşağıdaki inflamasyon araştırmak için tercih edilen yöntemlerden birini uyaran bir yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. TMCAo yöntemleri geliştikçe, silikon kaplı filamentlerin daha yakın zamanda kullanım daha başka modeller 9,10 <kıyasla subaraknoid kanama riskini azaltmak/ Sup> maalesef tMCAo sık sık enfarktüs hacimleri geniş bir varyasyon üreten olsa ve güvenilirliğini artırmak. 11-13 Bu çalışmaların çoğu 2,3,5 trifeniltetrazolyum klorür (TTC) ile boyanarak koronal beyin kesitlerinde enfarktüsü bölgeleri belirginleştiren, kabul edilen bir enfarktüs ölçümü için altın standart o canlı, yinelenebilir sonuçlar üretmek için basit ve ucuz bir yoldur çünkü. TTC mitokondri içinde mevcut dehidrojenazın bir alt-tabaka olarak hizmet eder. Beyin dilimleri TTC çözeltisi maruz kaldıklarında formazan non çözünür indirgeme ürünü, uygun bir mitokondrilerinde koyu kırmızı bir renk çöktürülmesi burada TTC seçici canlı hücre alınır. Çünkü iskemik dokuda mitokondriyal disfonksiyon, bu doku hasarlı ve sağlıklı doku farklılaşması için izin beyaz kalır. 14
TÜSP ayrıca iskemik yarımkürede BBB bozulması azaltır. 6. Bu nedenle, BBB bütünlüğünün ikili miktarının aynı b içindeTTC-tabanlı infarkt hacmi olarak yağmurlar endojen koruma dolu etkinlik ile ilgili faydalı bilgiler ve tedavi edilmemiş ve tedavi edilen hayvanlarda BBB bozulması ve enfarktüs arasındaki potansiyel nedensel ilişkileri sağlayacak 15 tespitler. inme ikincil bir kesintiye BBB, aracılığıyla periferik kandan akını sonuçta iskemik inmeli hastalarda enfeksiyon ve ölüm oranlarının artırılması, iskemik yarımkürede lökosit popülasyonları, pro-inflamatuar sitokinler, oksidatif stres, vazojenik ödem ve hemorajik dönüşümünü artırır . 16,17 hayvan modellerinde BBB bozulması ölçülmesi için yaygın bir yöntem, beyin içine Evans mavisi (EB) boya sızıntı niceliğinin belirlenmesine dayandığı. 15,18-21 EB seçici albümin, bir küresel serum proteinine bağlanan (MW = 65 kDa) Bu yaralanmamış hayvanlarda BBB aşmaz. 22 iskemik inme sonrasında, EB beyin infiltratlar ve optik yoğunluk withi ölçümü için izin 620 nm'de fluorescesn perfüze yaralı parankim. 22 optik yoğunluk EB transkardiyak perfüzyon ile otopsi kortikal damar yıkanıp olmuştur BBB geçirgenliği ile doğru orantılıdır. EB tatbikat hayvanlarda TTC-lekeli beyinleri hemen işleme ile, enfarktüs hacmi BBB bozulması hem etkin bir şekilde belirlenebilir. Bu nöronal yaralanma BBB bozulması inme sonrası beyinde eşlik işlemleri değildir Bununla birlikte, dikkat edilmesi gereken, 23,24 şekilde kurban süre seçimi, önemli bir husustur.
Aşağıdaki protokol RHP yöntemi, geçici bir arter tıkanıklık uyarılması için tMCAo yöntemini detayları bu modellerin insan hastalarda orta serebral arter tıkanıklıkları ve nöral ve vasküler inme yaralanma bitiş noktaları belirlemek için ikili histolojik yöntemler. TTC genel bir enfarktüs hacim ölçümü sağlayan, hücre ölümü ve toplu doku hasarı büyüklüğüneume, EB BBB hasar hemisferik ölçümü için sağlarken.
Sistemik hipoksi farelerde (yani, 2 saat% 11 O 2) Bir tek maruziyet "geçici" kısa ömürlü hipoksik ön hazırlık meydan epigenetik yanıtı anlam tMCAo, 29 beyni korur ve temel fenotip içinde geri günler. Hipoksik önkoşullama uyaranın Tekrarlanan sunumlar dramatik nöroprotektif fenotip süresini uzatmak. 6 Birçok çalışma tekrarlayan uyaran trenin sıklığı, büyüklüğü ve süresi bu yanıtın kritik belirleyicileri olduğunu göstermiştir. Örneği…
The authors have nothing to disclose.
Special thanks to the Gidday lab for their work in developing the RHP protocol, as well as the Neuro-Models Facility (UTSW) for their assistance in the tMCAo surgeries. This work was supported by grants from the American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS), and The Spastic Paralysis Research Foundation of the Illinois-Eastern Iowa District of Kiwanis International (JMG).
Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
15L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8mm diameter probe |
High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
250 mL isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
3mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
0.3cc insulin syringe with 29 g needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
TTC | Sigma | T8877 | |
10X PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
27g winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
1.7 mL microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |