Um ensaio para medir os efeitos do etanol sobre a velocidade de Locomotion Caenorhabditis elegans

Summary

C. elegans é um modelo útil para estudar os efeitos do etanol no comportamento. Apresentamos um ensaio comportamental que quantifica os efeitos do etanol na velocidade de locomoção de vermes rastejantes; Tanto a sensibilidade inicial quanto o desenvolvimento de tolerância funcional aguda ao etanol podem ser medidos com este ensaio.

Abstract

Os transtornos relacionados ao uso de álcool são um problema significativo de saúde pública, para o qual existem poucas estratégias de tratamento eficazes. Uma dificuldade que atrasou o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes é a relativa falta de compreensão dos fundamentos moleculares dos efeitos do etanol no comportamento. O nematóide, Caenorhabditis elegans (C. elegans), fornece um modelo útil para gerar e testar hipóteses sobre os efeitos moleculares do etanol. Aqui, descrevemos um ensaio que foi desenvolvido e usado para examinar os papéis de genes específicos e fatores ambientais nas respostas comportamentais ao etanol, nas quais a locomoção é a saída comportamental. O etanol depende da dose de causar uma depressão aguda de rastejar em uma superfície de ágar. Os efeitos são dinâmicos; Animais expostos a uma alta concentração demonstram uma forte depressão inicial de rastejamento, referida aqui como sensibilidade inicial, e depois recuperam parcialmente a velocidade de locomoção, apesar da presença contínua da droga. Essa plasticidade comportamental induzida pelo etanol é referida aqui como o desenvolvimento de tolerância funcional aguda. Este ensaio foi usado para demonstrar que esses dois fenótipos são distintos e geneticamente separáveis. O ensaio de locomoção simples descrito aqui é adequado para examinar os efeitos de manipulações genéticas e ambientais nessas respostas comportamentais agudas ao etanol em C. elegans.

Introduction

Os transtornos por uso de álcool (AUD) são generalizados e produzem sérios problemas de saúde, sociais e econômicos. Em humanos, a suscetibilidade ao desenvolvimento de um AUD é fortemente influenciada tanto pela genética quanto pelo ambiente^1,2. Um forte preditor fisiológico de responsabilidade por abuso é o nível inicial de resposta (RL) ao álcool (etanol) que é exibido por bebedores ingênuos^3-5. Este fenótipo LR é influenciado por componentes genéticos e não genéticos⁶. Determinar os mecanismos moleculares que influenciam a RL ao etanol é um objetivo importante do estudo dos comportamentos de resposta do etanol.

Protocol

1. Passos para executar no dia anterior ao ensaio

1. Escolha L4 vermes palco para meio de crescimento nematóide fresco (NGM) placas semeadas com um gramado de OP50 E. coli e cultura-los em 20 CO / N. Cada condição de ensaio requer 10 vermes; escolher um excesso de vermes para permitir O perda de vermes / N.
   1. Apenas animais de ensaio que são adultos do primeiro dia; muitos mutantes crescer a uma velocidade mais lenta do que o tipo selvagem. Ajuste o tempo de colheita para as estirpes que têm atrasos de desenvolvimento, de modo que todos os animais testados são adultos do primeiro dia.

2. Passos a exec....

Results

Os dados representativos (Figura 1) de vários genótipos diferentes e seus controles pareados são apresentados ^8,24; dados foram escolhidos especificamente que as diferenças de destaque nos animais testados. O grau de efeito de 10 min de exposição é considerada a sensibilidade inicial de uma estirpe, que é mostrada nos eixos esquerda na Figura 1B-G. Estirpes mutantes com uma maior velocidade relativa do que o controlo em 10 minutos são considerados como sendo resistentes etano.......

Discussion

A neurobiologia simples e ferramentas genéticas disponíveis em C. elegans fazer o sem-fim um excelente modelo para estudar as bases moleculares dos efeitos do etanol sobre o comportamento. Aqui, nós descrevemos um ensaio que foi utilizado para identificar vários mediadores moleculares e ambientais da resposta comportamental aguda para ethanol ^{8,10,20,24,25.} Este método permite a diferenciação e análise simultânea de dois fenótipos diferentes comportamento de resposta etanol, sensibilidade inicial e o.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cepas de C. elegans	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Placas de Petri, ventilação tripla	Greiner Bio-One	628161	Outras marcas de placas serão suficientes.
Ágar NGM	Vários		NaCl (3 g/L), ágar (17 g/L), peptona (2,5 g/L), 1 ml de colesterol (5 mg/ml em etanol), 1 ml (1 M) de MgSO4, 1 ml (1 M) de CaCl2, 25 ml (1 M) de KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Fórceps	Vários		e.g., Fisher Scientific #10300
37 ° C Incubadora	Vários		Para secagem de ágar
Balança digital	Vários		Para determinar pesos de placas e volume de ágar
Anéis de cobre	Plumbmaster	STK#35583 (junta de rosca de 48 tampas)	1,6 cm de diâmetro interno, 1,8 cm de diâmetro externo anéis de cobre
100% etanol	Vários
Parafilm M	Bemis	PM996
Câmera CCD	QImaging	RET-4000R-F-M-12	Esta câmera tem um grande campo de visão.
Estereomicroscópio com montagem em C e objetiva de 0,5X	Leica	MZ6	Modelo descontinuado, M60 é equivalente atual.
Fonte de luz	Schott	A08923	3" x3"   luz de fundo para iluminação uniforme em todo o campo de visão Software de
imagem e rastreamento	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	As versões mais recentes do software têm funções de rastreamento.