Este manuscrito descreve uma abordagem automatizada de seleção de tamanho de gel para purificar fragmentos de DNA para sequenciamento de próxima geração. A tecnologia Ranger fornece automação completa de todo o processo de carregamento de gel de agarose, análise eletroforética e recuperação de fragmentos de DNA direcionados, permitindo bibliotecas de sequenciamento de última geração de alto rendimento e alta qualidade.
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Artigo de método
Automated Gel seleção de tamanho para melhorar a qualidade das bibliotecas de sequenciação de próxima geração Preparado a partir de amostras de água do ambiente
Neste artigo
Resumo
Resumo
O sequenciamento de próxima geração de amostras ambientais pode ser desafiador devido à quantidade e qualidade variáveis de DNA nessas amostras. Bibliotecas de DNA de alta qualidade são necessárias para obter os melhores resultados do sequenciamento de próxima geração. Amostras ambientais, como água, podem ter baixa qualidade e quantidades de DNA, bem como contaminantes que co-precipitam com o DNA. Os processos mecânicos e enzimáticos envolvidos na extração e preparação da biblioteca podem danificar ainda mais o DNA. A seleção do tamanho do gel permite a purificação e recuperação de fragmentos de DNA de um tamanho definido para aplicações de sequenciamento. No entanto, essa tarefa é uma das etapas mais demoradas no fluxo de trabalho de preparação da biblioteca de DNA. O protocolo descrito aqui permite a automação completa do carregamento de gel de agarose, análise eletroforética e recuperação de fragmentos de DNA direcionados.
Neste estudo, descrevemos uma abordagem de alto rendimento para preparar bibliotecas de DNA de alta qualidade a partir de amostras de água doce que podem ser aplicadas também a outras amostras ambientais. Usamos uma abordagem indireta para concentrar células bacterianas de amostras ambientais de água doce; O DNA foi extraído usando um kit de extração de DNA disponível comercialmente, e as bibliotecas de DNA foram preparadas usando um protocolo comercial baseado em transposon. Fragmentos de DNA de 500 a 800 pb foram selecionados em tamanho de gel usando a Ranger Technology, uma estação de trabalho de eletroforese automatizada. O sequenciamento das bibliotecas de DNA selecionadas por tamanho demonstrou melhorias significativas no comprimento da leitura e na qualidade das leituras de sequenciamento.
Introdução
Metagenômica envolve o sequenciamento de todo o material genético em uma amostra para caracterizar as comunidades microbianas presentes. É um processo complexo e caro que envolve a conversão de ácidos nucléicos extraídos em bibliotecas de DNA, seguida de sequenciamento de última geração. Bibliotecas de alta qualidade são essenciais para a saída máxima de dados e análises metagenômicas precisas. Amostras ambientais, como amostras de água, muitas vezes representam desafios significativos para a geração de bibliotecas de alta qualidade, devido às baixas quantidades de DNA que também podem ser degradadas1-3 e à presença de inibidores da PCR4-6.
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Protocolo
1. Coleta de Água e Filtração
- Coletar amostras de água doce de vários sites (Figura 1). Passe amostras através de uma série de filtros: filtro de 1 um, 0,2 um filtro, e de 30 kDa de corte de filtro de fluxo tangencial para sistematicamente eucariótica separada, partículas de tamanho bacterianas e virais, respectivamente.
Nota: Apenas a purificação e análise do material recuperado nos filtros de 0,2 um (bactérias de vida livre) é descrito neste relatório, mas estratégias semelhantes podem ser usadas para outras partículas recuperadas a partir dos filtros.
2. Concentração bacteriana, ADN Extracção e Pu....
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Resultados
Concentração DNA, e Avaliação da Qualidade
As concentrações de DNA bacterianas, variou de 0,01-0,11 ng / ml por amostra de água dos diferentes sítios de bacias (Tabela 1). O ADN isolado a partir de uma fracção bacteriana teve 260/280 e 260/230 A rácios de 1,4 a 1,8 e 0,3 a 1,6, respectivamente. Enquanto alguns dos rácios Um 260/230 foram relativamente baixos, não foi observada inibição aparente na biblioteca preparada e out.......
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Discussão
A presença de dímeros de adaptador e aglomeração de pequenas dimensões de inserção preferencialmente sendo sequenciados em plataformas atuais representam uma diminuição nos rendimentos utilizáveis e subutilização da capacidade do equipamento 15. A utilização de métodos de batimento grânulos combinados com uma abordagem baseada no transposão para preparar bibliotecas podem resultar em mais de cisalhamento de ADN em comparação com os outros métodos de extracção de 4,5. No entanto, todos os métodos .......
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Divulgações
Jared R. Slobodan e Matthew J. Nesbitt tanto deter ações da Coastal Genomics, uma empresa British Columbia propriedade privada oferecendo a tecnologia Ranger.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Genome BC, Genome Canada e Coastal Genomics. Os autores agradecem a Kirby Cronin e Michael Chan por sua ajuda na coleta e processamento de amostras. Também gostaríamos de agradecer a Thea Van Rossum e à Dra. Fiona Brinkman pela assistência em bioinformática.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bomba peristáltica Masterflex P/S 1400 Series | Thermo Scientific | 1400-1620 | |
| 0,2 µ m Supor Membrane | VWR | CA28143-969 | Pall Corporation, Ann Harbor, MI |
| Esferas de carboneto de tungsténio 3 mm (200) | Qiagen | 69997 | |
| Álcool isopropílico 70% | Jedmon Products | 825751 | Healthcare Plus |
| DNA away | VWR | 7010 | Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA |
| Sistema de purificação de água Milli-Q | Fisher Scientific | ZMQS6VF0Y | Merck Millipore. Este sistema foi descontinuado. |
| 20x PBS pH 7.5 | VWR | E703-1L | Amresco, Inc., Solon, OH |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | Fisher chemicals |
| Adaptador de vórtice para 2 (50 ml) VWR | 13000-V1-50 | MoBio, Carlsbad, CA | |
| Vortex-Genie 2, 120 V (Modelo G560) | VWR | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. |
| Centrífuga Beckman | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd | Modelo J-6B | |
| PowerLyzer Powersoil Kit de isolamento de DNA | VWR | 12855-100 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Adaptador de vórtice para 24 tubos (1,5-2 ml) | VWR | 13000-V1-24 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Centrífuga Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nimbus Select com Ranger Technology | Hamilton Robotics | 92720-01 | Inclui a estação de trabalho de manuseio de líquidos e Ranger Tech integrado (hardware de eletroforese) |
| Kit de reagentes | Ranger Coastal Genomics | CG-10600-150-12-21 | Inclui buffer de carregamento e |
| Álcool etílico (anidro) | Álcoois comerciais | P016EAAN | Greenfield Etanol |
| Acetato de sódio | Sigma-Aldrich | S2889-250G | |
| Acrilamida linear (5 mg/ml) | Life Technologies | AM9520 | Ambion |
| Eppendorf centrífuga refrigerada | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. | 5417R | |
| Buffer EB (250 ml) | Qiagen | 19086 | |
| NanoDrop 1000 Espectrofotômetro | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit fluorômetro | Life Technologies | Q32857 | Invitrogen. Este produto foi descontinuado. |
| Kit de ensaio Qubit dsDNA HS | Life Technologies | Q32854 | Invitrogen |
| Reagente de DNA de alta sensibilidade | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Chips de DNA de alta sensibilidade | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent 2011 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| Nextera XT kit de preparação de amostras de DNA | Illumina | FC-131-1024 | |
| Kit de índice Nextera XT | Illumina | FC-131-1001 | |
| Kit de reagentes MiSeq v2 (500 ciclos) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Sistema Miseq | Illumina | SY-410-1003 |
Referências
- Siuda, W., Chrost, R. J. Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks. Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).
- Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. , Available from:
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Reimpressões e permissões
