सरलीकृत मानव न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (जाल) अलगाव और हैंडलिंग
Summary
निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम आसानी से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग करते हुए मानव पूरे रक्त से न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (नेट) को अलग करने के लिए एक बहुत ही सरल तरीके से वर्णन करते हैं। हम तो पृथक जाल कैंसर कोशिकाओं के साथ इन विट्रो आसंजन परख में इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है।
Abstract
न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (नेट) ने हाल ही में न्युट्रोफिल के रोगाणुरोधी साधन के हिस्से के रूप में पहचान की गई है। इसके अलावा संक्रमण से लड़ने में उनकी भूमिका से, हाल के शोध से वे कैंसर की प्रगति सहित कई अन्य रोग प्रक्रियाओं में शामिल किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया है। शुद्ध जाल अलग इन कार्यों के अध्ययन की अनुमति के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व है।
इस वीडियो में, हम आसानी से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग करते हुए मानव पूरे रक्त से सेल नेट मुक्त अलगाव की एक सरल विधि प्रदर्शित करता है। पृथक जाल तो immunofluorescence धुंधला, सोख्ता या विभिन्न कार्यात्मक assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस न्यूट्रोफिल खुद की संभावित confounding प्रभाव के अभाव में उनके जीवविज्ञान गुण के एक आकलन के लिए सक्षम बनाता है।
एक घनत्व ढाल जुदाई तकनीक स्वस्थ दाता पूरे रक्त से न्यूट्रोफिल अलग करने के लिए कार्यरत है। पृथक न्यूट्रोफिल तो phorbol 12 MYR द्वारा प्रेरित कर रहे हैंistate 13-एसीटेट (पीएमए) NETosis प्रेरित करने के लिए। सक्रिय न्यूट्रोफिल तो खारिज कर रहे हैं, और एक सेल मुक्त नेट शेयर प्राप्त की है।
हम तो A549 मानव फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं के साथ एक आसंजन परख में इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे अलग-थलग जाल प्रदर्शित करता है। नेट स्टॉक कोट करने के लिए जोड़ रहे हैं एक साथ 96 सेल संस्कृति की थाली हे / एन, और कुओं के तल पर एक पर्याप्त नेट monolayer के गठन को सुनिश्चित करने के बाद, CFSE लेबल वाले A549 कोशिकाओं के कुओं प्रयोग किया जाता है। पक्षपाती कोशिकाओं एक Nikon TE300 फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग मात्रा निर्धारित कर रहे हैं। कुछ कुओं में, 1000U DNAse1 जाल नीचा करने के लिए गिनती से पहले 10 मिनट के लिए जोड़ा जाता है
Introduction
न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (नेट) नव प्रोटीन और हिस्टोन के सैकड़ों द्वारा सजाया कोशिकी डीएनए की किस्में से बना न्युट्रोफिल व्युत्पन्न तत्वों की खोज कर रहे हैं। वे विशिष्ट उत्तेजनाओं निम्नलिखित संक्रमण और सूजन के संदर्भ में न्यूट्रोफिल द्वारा स्रावित होते हैं और वे शुरू में संक्रमण के खिलाफ न्यूट्रोफिल की रक्षा तंत्र का हिस्सा बनने के लिए मान्यता प्राप्त किया गया। वे पहली बार बैक्टीरिया, वायरस और कवक 1-3 सहित विभिन्न माइक्रोबियल आक्रमणकारियों के फँसाने बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। सूक्ष्म जीव की फँसाने तो इसके विनाश के लिए दोनों सीधे नेट से जुड़े प्रोटीन 3,4 द्वारा और परोक्ष रूप से phagocytic कोशिकाओं 5,6 के स्थानीय भर्ती के माध्यम से नेतृत्व करेंगे। नेट की भूमिका हालांकि रक्षा की मेजबानी के लिए सीमित होना प्रतीत नहीं होता। हाल ही में, वे, 9 घनास्त्रता, autoimmune रोग 7,8 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए गर्भावस्था से संबंधित विकारों 10 और यहां तक कि कैंसर प्रगति दिखाया गया है11,12। तदनुसार, यह जाल विविध शारीरिक प्रक्रियाओं की एक बड़ी संख्या में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि प्रतीत होता है। हालांकि, इस तरह के अनुसंधान के उपन्यास प्रकृति को देखते हुए, बहुत जाल उनके प्रभाव डालती है जिसके द्वारा तंत्र के संबंध में elucidated जाना बना रहता है। इस के साथ साथ, हम neutrophils के अभाव में नेट के अलगाव के लिए एक सरल तरीका मौजूद है।
निम्नलिखित वीडियो में, हम मानव पूरे रक्त से नेट अलग करने के लिए एक सरल और आसान तकनीक का प्रदर्शन। सेल मुक्त जाल तो ऐसे आसंजन, प्रसार और प्रवास रूप assays के एक संख्या के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सोख्ता, धुंधला, imuunofluorescence सहित इन विट्रो प्रयोगों की एक संख्या में इस्तेमाल किया जा सकता है। अन्य प्रोटोकॉल हालांकि वे आम तौर पर, लंबा जटिल, महंगा है, और अक्सर, कम उपज 13 हैं, 13, 19 में मौजूद हैं। इस सरल प्रोटोकॉल इसलिए procedu की लंबाई कम से कम बुनियादी अभिकर्मकों का उपयोग करता है और न्यूट्रोफिल को अलग-थलग करने के लिए आवश्यक कदम की संख्या कम हो जाती हैउपज है जबकि अधिकतम पुनः।
निम्न विधि न्युट्रोफिल अलगाव के लिए विभिन्न तकनीकों पहले से लाइव न्यूट्रोफिल की एक बहुत ही शुद्ध नमूना उपज एक साधारण प्रोटोकॉल प्राप्त करने के लिए साहित्य में वर्णित को जोड़ती है। साहित्य में सुझाव दिया है, शिरापरक रक्त EDTA के ट्यूब में एकत्र की है और न्युट्रोफिल सक्रियण 14 से बचने के लिए 10 मिनट के भीतर प्रयोग किया जाता है। हम heparinized पूरे रक्त, शुरू में Boyum एट अल 15 द्वारा वर्णित Ficoll घनत्व centrifugation तकनीक से अनुकूलित एक विधि से granulocytes और लाल रक्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए लिम्फोसाइट पृथक्करण मीडिया (एल एस एम) घनत्व ढाल centrifugation का उपयोग करें। एल एस एम सोडियम metrizoate के लिए सोडियम diatrizoate विकल्प और न्यूट्रोफिल 16-18 अलग करने के लिए कई अध्ययनों में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है कि Boyum तैयार करने की एक संशोधन है।
अंतर घनत्व centrifugation, monocytes और लिम्फोसाइटों खारिज कर रहे हैं निम्नलिखित; लाल रक्त कोशिकाओं तो sedimented रहे हैंएक 6% dextran समाधान 14 का उपयोग कर और शेष लाल रक्त कोशिकाओं Trypan नीले और Methylene नीले धुंधला के साथ सत्यापित है जो शुद्ध न्यूट्रोफिल, की आबादी प्राप्त करने के लिए lysed रहे हैं।
कई एजेंटों lipopolysaccharide (LPS), और phorbol myristate एसीटेट (पीएमए) और interleukins (आईएल 8) 3,5,6 सहित इन विट्रो में और vivo में दोनों NETosis प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, अलग-थलग न्यूट्रोफिल apoptosis को 19,20 बढ़ावा देने के बिना सुसंगत और विश्वसनीय नेट गठन की अनुमति के लिए एक पर्याप्त एकाग्रता होना दिखाया गया है, जो चार घंटे के लिए 500 एनएम पीएमए के साथ प्रेरित कर रहे हैं।
अलगाव के बाद, हम इस प्रोटोकॉल से प्राप्त सेल मुक्त जाल एक आसंजन परख में इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है। DNAse1 पचाने और पहले से वर्णित के रूप में जाल नीचा करने के लिए प्रयोग किया जाता है और इस तरह एक नियंत्रण 2,3,11 रूप में कार्य करता है। अन्य विकल्प नेट formati को बाधित करने के लिए न्युट्रोफिल इलास्टेज अवरोध करनेवाला (नै) के उपयोग में शामिललक्ष्य नेट गठन को बाधित करने के बजाय उनके गिरावट 11 लागू करने के लिए जब एक स्वीकार्य विकल्प है, जो पर। नै विभिन्न कार्यों का एक नंबर है, यह पहले से नेट बयान क्रोमेटिन decondensation, परमाणु degranulation और न्युट्रोफिल मौत 12 की रुकावट के माध्यम से नै से हिचकते जा सकता है कि दिखाया गया है
Protocol
Representative Results
Discussion
इस वीडियो में प्रदर्शन न्युट्रोफिल कोशिकी जाल अलगाव प्रोटोकॉल न्युट्रोफिल अलगाव और NET गठन के लिए साहित्य में इस्तेमाल विभिन्न तकनीकों को जोड़ती है। यह एक काफी जटिल और चर प्रक्रिया को सरल और अन्य प्रो?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm) | Falcon | 353025 |
Referências
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