Упрощенный нейтрофилов человека Внеклеточные Ловушки (НРТ) Изоляция и регулировать
Summary
В следующем протоколе, мы описать очень простой способ, чтобы изолировать нейтрофилов внеклеточной ловушки (сетки) из цельной крови человека, используя легко доступные реагенты. Затем показано, как изолированные сети могут быть использованы в лабораторной адгезии анализа с раковыми клетками.
Abstract
Нейтрофилов внеклеточных ловушек (НРТ) были недавно определены как часть антимикробной арсенал нейтрофилов в. Помимо их роли в борьбе с инфекциями, недавнее исследование показало, что они могут быть вовлечены во многих других болезненных процессов, в том числе прогрессирования рака. Изоляция очищенные сеток важным элементом, чтобы изучение этих функций.
В этом видео, мы демонстрируем упрощенный метод свободного разделительная сетка клеток из цельной крови человека, используя легко доступные реагенты. Изолированные НРТ может быть использован для иммунофлуоресцентного окрашивани, промокательной или различных функциональных анализов. Это позволяет оценить их биологических свойств в отсутствие потенциальных вмешивающихся эффектов самих нейтрофилов.
Методика градиента плотности разделения используется для выделения нейтрофилов у здоровых доноров цельной крови. Изолированные Затем нейтрофилы стимулировали форболовым 12-млн летistate 13-ацетата (РМА), чтобы вызвать NETosis. Активированные нейтрофилы, затем отбрасываются, а NET акции без клеток получается.
Затем показано, как изолированные сети могут быть использованы в анализе адгезии с клетками рака легкого А549 человека. NET акции используется для покрытия лунок 96-луночного культуры клеток пластина O / N, и после обеспечения адекватной системы образования монослоя на дне лунок, CFSE меченых клеток А549 будут добавлены. Прикрепленные клетки количественно с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon TE300. В некоторых скважинах 1000U DNAse1 добавляется 10 мин перед подсчетом деградировать сетей не
Introduction
Нейтрофилов внеклеточных ловушек (НРТ) недавно обнаружили элементы нейтрофилов, полученных состоящие из нитей внеклеточной ДНК, украшенный сотнями белков и гистонов. Они вырабатываются нейтрофилов в контексте инфекции и воспаления следующие конкретные стимулы, и они были первоначально признаны как часть нейтрофилов в защитных механизмов против инфекции. Они были впервые показаны в целях содействия захвата различных микробных захватчиков в том числе бактерий, вирусов и грибков 1-3. Захват микроба бы затем привести к его разрушению как непосредственно Net-ассоциированных белков 3,4 и косвенно, через местной основе фагоцитирующих клеток 5,6. Роль сетей, однако, похоже, не ограничивается иммунной защиты. Совсем недавно, они, как было показано, играют важную роль в аутоиммунных заболеваний 7,8, тромбоз 9, связанных с беременностью расстройств 10 и даже прогрессирование рака11,12. Соответственно, очевидно, что НРТ играют важную роль в большом количестве различных физиологических процессах. Однако, учитывая роман характер таких исследований, многое еще предстоит выяснить в отношении механизмов, посредством которых НРТ проявляют свое действие. Здесь мы представляем упрощенный метод для изоляции сетей при отсутствии нейтрофилов.
В следующем видео мы демонстрируем Простота и удобство технику, чтобы изолировать сетей с помощью цельной крови человека. Бесклеточные НРТ затем могут быть использованы в ряде экспериментов в пробирке в том числе окрашивание, imuunofluorescence, блоттинга, а также ряда анализов, таких как адгезии, пролиферации и миграции. Существуют и другие протоколы, 13, 19, тем не менее, они, как правило, длительный, сложный, дорогостоящий, и часто, низкий выход 13. Этот упрощенный протокол использует основные реагенты и уменьшает количество шагов, необходимых для выделения нейтрофилов, следовательно, свести к минимуму длину процедуры, применяемыеRe при максимальном урожай.
Следующий метод сочетает в себе различные методы для выделения нейтрофилов ранее описаны в литературе, чтобы получить простой протокол получая очень чистый образец живых нейтрофилов. Как было предложено в литературе, венозной крови собирают в пробирки с ЭДТА и использовать в течение 10 мин, чтобы избежать активации нейтрофилов 14. Мы используем лимфоцитов раздела сред (МНК) центрифугирования в градиенте плотности для выделения гранулоциты и эритроциты из гепаринизированной цельной крови, способу приспособленного с техникой плотности Ficoll центрифугированием первоначально описанной Boyum и др 15. LSM является модификация состава Boyum, который замещает диатризоат натрия для metrizoate натрия и успешно используется во многих исследованиях, чтобы изолировать нейтрофилы 16-18.
После дифференциального центрифугирования в градиенте плотности, моноциты и лимфоциты отбрасываются; красные кровяные клетки затем осаждаютс использованием 6% -ного раствора декстрана 14, а остальные эритроциты лизируют, чтобы получить население чистой нейтрофилов, что проверяется с трипанового синего и метиленовый синий окрашивания.
Многочисленные агенты были использованы для индуцирования NETosis как в пробирке и в естественных условиях, в том числе липополисахарида (LPS), а также форболмиристатацетата (РМА) и интерлейкины (IL-8) 3,5,6. В следующем протоколе, изолированные нейтрофилы стимулировали 500 нМ ФМА в течение 4 ч, который, как было показано, чтобы быть адекватной концентрации, чтобы обеспечить постоянное и надежное формирование чистого, не способствуя апоптозу 19,20.
После выделения, показано, как бесклеточных НРТ, полученные из этого протокола могут быть использованы в анализе адгезии. DNAse1 используется, чтобы переварить и ухудшает сетей не как описано выше, и, таким образом, служит в качестве контроля 2,3,11. Другие варианты включают в себя использование ингибитора эластазы нейтрофилов (Nei) ингибировать NET formatiна, который является приемлемой альтернативой, когда цель заключается в ингибировании формирование чистого, а не производить их деградации 11. Хотя NEi имеет ряд различных функций, ранее было показано, что NET осаждения может быть запрещена по Неи через блокирование хроматина деконденсации, ядерной дегрануляции и нейтрофилов смерти 12
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол изоляция Trap нейтрофилов внеклеточной показано в этом видео сочетает в себе различные методы, используемые в литературе для изоляции нейтрофилов и формирование чистого. Это упрощает достаточно сложный и переменный процесс и предлагает очень надежную и воспроизводимую спосо?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm) | Falcon | 353025 |
Referências
- Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA. PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. NETs: a new strategy for using old weapons. Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).
- McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis. Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
- Khandpur, R., et al. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss. Front Immunol. 3, 362 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. J Clin Invest. , (2013).
- Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. Neutrophil extracellular traps in cancer progression. Cell Mol Life Sci. , (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), (2010).
- Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils. Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).
- Boyum, A. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).
- Calado, R. T., et al. Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells. Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).
- Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. Characterization and regulation of bv8 in human blood cells. Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).
- Wu, Y. J., et al. In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).
- Saffarzadeh, M., et al. Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones. PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
