효소 방법은 응고 골수 샘플에서 중간 엽 줄기 세포를 구출
Summary
Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.
Abstract
Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.
Introduction
중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포)는 재생 의학 및 조직 공학에 중요한 역할을합니다. 그들은 그들에게자가 치료 2,3를위한 이상적인 후보자를 표현하는 다양한 세포 유형 1로 분화와 접목, 마이그레이션 할 수 있습니다. 최근, 뼈와 연골 수리를 위해 중간 엽 줄기 세포를 이용하여 임상 시험은, 호스트 질환이나 심장 질환 이식편 대 4를 출시했다. 이러한 중간 엽 줄기 세포는 제대혈이나 지방 조직에서 수확 할 수 있지만 가장 유망한 결과는 골수 유래 줄기 세포 5 얻었다.
장골 골수 상당한 양의를 수집 할 수 있으므로 흡인 6의 메인 사이트의 역할을한다. 그러나 대기음의 품질 인출 골수 부피가 증가함에 따라 감소한다. 골수 흡 인물의 제 5 ㎖ 고품질의 중간 엽 줄기 세포를 포함하는 반면, 많은 양의 취하 말초 혈액 F와 흡 인물의 희석에 이르게높은 혈관 뼈 7 롬. 항응고제를 사용하지 않고서 본 거핵 혈소판, 골수 흡 인물은 응고되기 쉽다. 그러나 심지어 항응고제, 혈전이 발생할 수 있습니다.
골수에서 중간 엽 줄기 세포는 전체 풀 (8)의 단지 작은 부분을 나타내고, 대부분의 조직 공학 또는 치료 응용 4 배양에서 확장해야한다. 이러한 문화의 품질은 크게 초기 셀 풀, 즉에 따라 달라집니다., 다양성과 높은 기동 번호 9. 인출에서 중간 엽 줄기 세포의 낮은 숫자는 부분적으로 기증자의 변화에 의해 설명 될 수있다. 한편, 낮은 품질의 샘플들로부터 중간 엽 줄기 세포의 수를 달성하기 위해 더 긴 시간 배양 및 계대 확장을 필요로한다. 어느 경우에도, 연장 계대는 세포 노화의 소스이고 10 분화 잠재력의 손실을 초래할 수있다. 따라서, 셀 (Y)을 극대화 할 수있는 프로토콜을 최적화과의 ield 11,12 악영향이 개발 될 필요가 방지.
우리가 개 중간 엽 줄기 세포와 함께 작업을 시작했을 때 다행히 응고 인간의 샘플 (열에서 하나) 덜 자주있는 동안, 우리는 3 ~ 4 개에서 골수 샘플 혈전 포함 된 것을보고 깜짝 놀랐다. 반면에 우리가 응고 샘플에서 중간 엽 줄기 세포의 훨씬 낮은 수익률을 관찰하는 것이, 놀랍지 않습니다. 응고 된 샘플의 반복 문제를 해결하기 위해, 우리는 리샘플링 대신 혈전 용해 약물 유로 키나아제를 사용하는 프로토콜을 개발했다.
혈전 용해 요법은 심장 마비, 뇌졸중 또는 때문에 원치 않는 응고의 색전증을 일으키는 혈관의 폐색과 같은 생명을 위협하는 상황에 대처 할 수 있습니다. 그들은 플라스 민과 효소 플라스 미노 겐 활성제에 의한 섬유소의 효소 분해를 통해 혈전의 분해에 의해 작동합니다. 환자의 치료에 널리 사용에도 불구하고, 매우 소수의 서적은 활용도가 혈전 활동하는 것이 존재실험실 응용 프로그램이 응고 샘플을 구출하기 위해, 대부분의 림프구에 초점을 맞추고. 1987 년, 니쿠 등. (13)와 4 년 뒤 기능 림프구의 결과로 혈전을 용해 스트렙토의 사용을 설명, 드 비스 등. 유세포 애플리케이션 (14)에 대한 혈액 및 골수에서 백혈병 세포를 분리 스트렙토의 사용을 확장. 최근 간행물은 암 진단 15 Alteplase의 사용을 제안한다. 동일한 효소 적 방법을 사용하는 동안, 우리는 프로토콜 줄기 세포 연구 분야를위한 툴을 제공하는 MSC의 분화능 양식 골수의 분리에 초점을 맞춘다.
Protocol
Representative Results
Discussion
환자가 약간의 추가 작업 만이 동작 극장 요원에 의해 수행되어야하는 이점, (우리의 경우 주로 척추 수술) 수술을하는 동안 일상적으로 우리는 골수 샘플. 샘플은 즉시 인출 후 구연산 나트륨과 혼합 되더라도 그들이 처리 실험실에 도착했을 때, 많은 샘플이 부분적으로 응고했다. 이 단계에서, 응고 표본을 대체 할 리샘플링은 별도의 추가 작업이 다시 로컬 또는 전신 마취 6 필요로 할 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.
Materials
| Basal Medium Components | ||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 |
| Adipogenic Medium Components | ||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I |
| Insulin | Sigma | I5500 |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 |
| Biotin | Sigma | B4639 |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 |
| Pantothenate | Sigma | P5155 |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 |
| Osteogenic Medium Components | ||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 |
| Chondrogenic Medium Components | ||
| Biopad – sponge shaped medical device | Euroresearch | |
| L-proline | Sigma | P5607 |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 |
| Generic | ||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 |
| PBS | Applichem | 964.9100 |
| Urokinase | Medac | 1976826 |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 |
| Consumables | ||
| 50 mL reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S |
| 10 mL syringe | Braun | 4606108V |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 |
| 1.7 mL Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 |
| cell culture flask – Flask T300 | TPP | 90301 |
| Equipment | ||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 |
| water bath | Memmert | 1305.0377 |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea |
| microscope | Olympus | CKX41 |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
Referências
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