Een enzymatische methode om mesenchymale stamcellen te redden van klonterde beenmergmonsters
Summary
Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.
Abstract
Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.
Introduction
Mesenchymale stamcellen (MSC's) spelen een belangrijke rol in de regeneratieve geneeskunde en tissue engineering. Ze kunnen migreren, differentiëren in verschillende celtypes 1 en inenten, waardoor ze de ideale kandidaten voor autologe therapieën 2,3 maakt. De laatste tijd, klinische studies met behulp van MSC's voor bot en kraakbeen reparatie, graft-versus-host ziekte of hart-en vaatziekten werden gelanceerd 4. Deze MSC's kunnen worden geoogst uit de navelstreng of vetweefsel maar veelbelovende resultaten werden verkregen uit beenmerg afgeleide stamcellen 5.
De iliac crest maakt een aanzienlijke hoeveelheid beenmerg verzamelen en dient derhalve hoofdplaats aspiratie 6. De kwaliteit van het aspiraat afneemt met toenemende hoeveelheid beenmerg ingetrokken. Terwijl de eerste 5 ml beenmergaspiraat bevatten MSC's van hoge kwaliteit, de intrekking van grotere volumes leidt tot verwatering van het aspireren met perifere bloed fROM De vaatrijke bot 7. Door de onderhavige megakaryocyten en bloedplaatjes, beenmerg aspiraten zijn verklonteren, tenzij anticoagulantia gebruikt. Maar zelfs met anticoagulantia, kunnen stolsels voordoen.
In beenmerg MSCs slechts een klein deel van het totale celpool 8 en moet in kweek geëxpandeerd meeste tissue engineering of therapeutische toepassingen 4. De kwaliteit van een dergelijke cultuur is grotendeels afhankelijk van de initiële cel zwembad, dwz., Diversiteit en een hoog startnummer 9. Lage aantallen MSC's uit de markt nemen kan gedeeltelijk verklaard worden door donor variabiliteit. Aan de andere kant, MSC's van lage kwaliteit monsters vereisen een langere tijd in cultuur en uitgebreid passage naar het gewenste aantal cellen te bereiken. In beide gevallen verlengd passages is een bron van celsenescentie en kan leiden tot verlies van differentiatie potentieel 10. Daarom geoptimaliseerde protocollen die cel y kunnen maximaliserenield en te voorkomen dat nadelige gevolgen moeten worden ontwikkeld 11,12.
Toen we begonnen te werken met honden MSC's, we waren verbaasd om te zien dat ongeveer drie op de vier honden beenmerg monsters bevatte stolsels, terwijl gelukkig clotted menselijke stalen (één op de tien) waren minder frequent. Aan de andere kant was het geen verrassing, dat zagen we veel lagere opbrengst van MSC's uit gestolde monsters. Om de steeds terugkerende probleem van de gestolde monsters op te lossen, het protocol ontwikkelden we met behulp van de trombolyticum urokinase in plaats van resampling.
Trombolytische therapie kan levensbedreigende situaties als afsluiting van de bloedvaten hartaanval, beroerte of embolieën door ongewenste stolling tegengaan. Zij werken door afbraak van de stolsels door enzymatische splitsing van fibrine door plasmine en enzymatische plasminogeen activatoren. Ondanks het ruime gebruik voor de behandeling van patiënten, slechts zeer weinig publicaties bestaan die gebruikt trombolytische activiteitenvoor laboratorium toepassingen gestolde monsters redden, vooral gericht op lymfocyten. In 1987, Niku et al. de toepassing beschreven van streptokinase voor het oplossen van bloedstolsels resulteert in functionele lymfocyten 13 en vier jaar later, De Vis et al. uitgebreid gebruik van streptokinase leukemiecellen isoleren uit bloed en beenmerg flowcytometrische toepassingen 14. Een meer recente publicatie suggereert het gebruik van Alteplase voor de diagnostiek van kanker 15. Tijdens het gebruik van de dezelfde enzymatische benadering, ons protocol richt zich op de isolatie van multipotente MSC vorm beenmerg om een hulpmiddel voor onderzoekers op het gebied van stamcellen bieden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Routinematig proeven we beenmerg terwijl de patiënt ondergaat een operatie (in ons geval vooral wervelkolom chirurgie), met het voordeel dat slechts weinig extra werk heeft verricht door het personeel in de operatiekamer te voeren. Hoewel de monsters onmiddellijk na verwijdering worden gemengd met natriumcitraat, vele monsters werden gedeeltelijk gestold bij hun aankomst in het laboratorium voor verwerking. In dit stadium zou resampling om clotted exemplaren te vervangen afzonderlijke extra ingreep weer noodzakelijk pl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.
Materials
| Basal Medium Components | ||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 |
| Adipogenic Medium Components | ||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I |
| Insulin | Sigma | I5500 |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 |
| Biotin | Sigma | B4639 |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 |
| Pantothenate | Sigma | P5155 |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 |
| Osteogenic Medium Components | ||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 |
| Chondrogenic Medium Components | ||
| Biopad – sponge shaped medical device | Euroresearch | |
| L-proline | Sigma | P5607 |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 |
| Generic | ||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 |
| PBS | Applichem | 964.9100 |
| Urokinase | Medac | 1976826 |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 |
| Consumables | ||
| 50 mL reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S |
| 10 mL syringe | Braun | 4606108V |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 |
| 1.7 mL Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 |
| cell culture flask – Flask T300 | TPP | 90301 |
| Equipment | ||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 |
| water bath | Memmert | 1305.0377 |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea |
| microscope | Olympus | CKX41 |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
Referências
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research–bench to bedside and back–myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
