주사 전자 현미경으로 간 사인 내피 세포의 분석 및 그들의 Fenestrations위한 표준화 된 방법
Summary
The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.
Abstract
Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures – both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.
Introduction
간 사인 내피 세포 (LSECs)는 매우 간 사인 곡선의 벽을 일렬로 차별화 된 내피 세포 수 있습니다. LSECs가 아닌 diaphragmed 있습니다 fenestrations으로 천공되어, 세포 횡단는 직경이 50 ~ 250 nm의 모공. LSECs의 표면의 20 %까지 체 플레이트 1-3 (도 1)라고 수십 내지 수백 그룹 보통 fenestrations 의해 덮여있다. Fenestrations는 고효율 한외 여과 시스템을 구축, 및 혈장 혈액 간세포 nanosubstrates 사이의 전송을 허용한다. Fenestrations 동적 구조입니다 – 크기 및 / 또는 번호가 모두 다양한 생리 학적 상태, 약물, 질병에 대한 응답으로 변경 될 수 있습니다. 예를 들어, fenestrations는 공급 상태 4보다 금식에 큰; 세포 노화와 여러 질병 상태 7-13에서 발생 당 5, 6 및 크기의 감소 및 fenestrations 수 2 디 iodoamphetamine는 창호 수를 증가 </sup>. fenestrations의 크기 및 수의 정확한 측정 LSEC 모폴로지는 다양한 질환, 독성, 및 생리적 상태에 의해 영향을받는 방법을 이해하는 것이 중요하다; 간 기능에 미치는 영향; 개발에 대한 치료 적 개입 1 창호를 변조.
fenestrations의 연구는 어렵다. 그대로 간 조직 또는 배양 LSECs 모두 이전에는 관찰하여 전자 현미경이 가능했습니다 있도록 fenestrations의 직경은, 기존의 광학 현미경의 해상도 아래에 자리 잡고 있습니다. 주사 전자 현미경 (SEM)을 자주, SEM은 수천 내피 표면 및 측정의 큰 영역의 관찰이 가능하기 때문에 창호의 크기, 주파수 및 공극률 (fenestrations 의해 천공 LSEC 막의 백분율)를 연구하기 위해 사용되어왔다 하지 수만 fenestrations 수천의 경우. 그 유틸리티에도 불구하고,에서보고 된 결과에 대한 연구를 SEM을 기반이러한 창호 크기, 수, 빈도와 같은 다공성 LSEC 파라미터는 문헌 (표 1)에서 광범위하게 다양하다.
Fenestrations 및 체 플레이트 계약, 휴식 팽창 또는 표본 준비 중 합체 깨지기 쉬운 구조입니다, 따라서 신중한 처리를 자신의 무결성을 유지하기 위해 필요합니다. 상승 관류 압 (14); 정착 및 버퍼 (15)의 잘못된 삼투압; 부적절한 고정 또는 고정 시간; 및 사후 고정 탈수 및 건조 속도는 미세 구조의 보존을 방해 유물 (그림 2)을 생성 할 수 현미경에 대한 처리의 모든 영역입니다. fenestrations 손실 ( 'defenestration') 및 창호 수축 저감 창호 직경 셀 다공성 결과 불량한 고정의 결과로서 발생할 수있다. SEM 분석을위한 시료의 보존을 개선하기위한 방법은 앞에서 설명 15-17되었고 논의 될여기에 표본 보존을 개선하는 방법에 대한 팁. 시험편 보존 주요 목표는 LSEC의 표면이 가시화 될 수 있도록 정현파에서 혈액을 제거하고, 고압 또는 지연 고정 하나에서 LSEC 손상을 방지한다. 포털 정맥을 통해 정착의 항목 간 관류 간 고정을 위해 선호하는 방법입니다. 상세하게 설명한 바와 같이 다른 곳에서 16, 18 관류가 낮은 압력에서 수행되어야한다 (예를 들면 H 2 0 10cm) LSEC에 압력 관련 관류 유물과 손상을 방지하려면, 일반적으로 세포막에 내 큰 격차를 나타내. 다른 19 상세히 설명하지만, 적절한 정착 종종, 사람과 동물에서 간 생검 바늘 관류를 사용하여 얻을 수있다. 혈액 샘플에서 플러시 될 때까지이 방법은 조직으로 직접 주사를 포함 고정액과 조직은 견고하고 고정된다. 전자 현미경 샘플의 고정이 반환 한 할 필요가간은 매우 신속한자가 분해 공정의 결과로서 발생하는 미세 구조적 변화를 방지하는 혈류의 중단 다음 최대한 빨리 ORMED.
또한 인공물의 포함을 최소화하고 fenestrations의 측정을 표준화 이미지 분석의 방법을 제시한다. 다공성 및 창호 주파수 현미경에 대한 사인 곡선의 선택의 변화, 인공물의 이미지 분석, 셀 면적의 측정은 발표 결과에 큰 차이를 주도했다. 평가 및 fenestrations 및 데이터 프리젠 테이션에 대한 최소 요구 사항을 측정하는 표준화 된 접근 방식은 분명히 이전 4,10,20-31 문헌에 언급되지 않았다.
Protocol
Representative Results
Discussion
정확하고 재현성 간 정현파 내피의 상태를 측정하는 기능이 고도로 전문화 된 세포의 생물학을 이해하는데 중요한 단계이다. 구조화 조명 현미경 (32), 원자력 현미경 (33) 및 D-STORM (직접 확률론 광학 Reconstrucion 현미경) (34) 같은 새로운 기술은 시험 관내에서 이러한 세포의 형태에 관한 중요한 정보를 부여하지만 SEM 시각화하고 자신의 구조를 측정하는 주 방?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of material | Company | Catalogue Number | Comments |
| EM grade Glutaraldehyde | ProSciTech | C001 | Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze |
| Paraformaldehyde powder | Sigma Aldrich | 158127 | Always prepare Paraformaldehyde fresh |
| Sodium Cacodylate powder | Sigma Aldrich | C0250 | Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016 | Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O |
| Osmium tretroxide | ProSciTech | C011 | Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle |
| Ethanol- Absolute | Sigma Aldrich | 459836 | 100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve |
| Other grades of Ethanol | Labtech | EL5 | Prepare graded Ethanols with dH2O |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 52619 | Allow to reach room temperature before use |
| Cannulas | Terumo | TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C | 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice |
| Conductive Carbon tape | ProSciTech | IA0201 | |
| Carbon Paint | ProSciTech | I003 | |
| Ketamine | Must be optained under licence | ||
| Xylazine | Must be obtained under licence | ||
| Molecular Sieve | Sigma Aldrich | 208647 | Removes water from the 100 % Ethanol |
Referências
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