Un método estandarizado para el análisis de las células del hígado sinusoidal endoteliales y sus Fenestraciones por Microscopía Electrónica de Barrido
Summary
The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.
Abstract
Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures – both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.
Introduction
Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSECs) son altamente células endoteliales diferenciadas que recubren la pared de la sinusoide hepático. LSECs están perforadas con fenestraciones que no son diaphragmed, transcelular poros de 50-250 nm de diámetro. Hasta el 20% de la superficie de LSECs está cubierto por fenestraciones, que son por lo general en grupos de decenas a cientos llamadas placas de tamiz 1-3 (Figura 1). Fenestraciones permiten la transferencia de plasma y nanosubstrates entre la sangre y los hepatocitos, la creación de un sistema de ultrafiltración altamente eficiente. Fenestraciones son estructuras dinámicas – tanto por su tamaño y / o el número puede ser alterado en respuesta a diversos estados fisiológicos, las drogas y las enfermedades. Por ejemplo, fenestraciones son más grandes en el ayunas que en el estado alimentado 4; 2-di-iodoamphetamine aumenta número fenestración; 5,6 y una reducción en el tamaño y número de fenestraciones por célula se produce en el envejecimiento y muchos estados de enfermedad 7-13 </sup>. La medida exacta del tamaño y número de fenestraciones es importante para la comprensión de cómo las CESH morfología está influenciada por diversas enfermedades, tóxicas, y los estados fisiológicos; su impacto en la función hepática; y para el desarrollo de la fenestración de modulación de las intervenciones terapéuticas 1.
El estudio de fenestraciones es difícil. El diámetro de fenestraciones se encuentra por debajo de la resolución de la microscopía de luz convencional, por lo que antes sólo la observación mediante microscopía electrónica tanto en tejido hepático o cultivadas LSECs intactas ha sido posible. El microscopio electrónico de barrido (SEM) con más frecuencia ha sido utilizado para estudiar el tamaño de la fenestración, la frecuencia y la porosidad (el porcentaje de membrana CESH que está perforada por fenestraciones) porque SEM permite la observación de grandes áreas de la superficie endotelial y la medición de miles, si no decenas de miles de fenestraciones. A pesar de su utilidad, los resultados que se informan de los estudios SEM-basados paraCESH parámetros tales como el tamaño fenestración, número, la frecuencia y la porosidad varían ampliamente en la literatura (Tabla 1).
Fenestraciones y placas de tamiz son estructuras frágiles que contrato, rompen, dilatan o se unen durante la preparación de la muestra, se requiere procesamiento tanto cuidado para preservar su integridad. La presión de perfusión elevada 14; osmolaridad incorrecta del fijador y tampones de 15; fijación inadecuada o la fijación del tiempo; y la velocidad de deshidratación post-fijación y secado son todas las áreas de procesamiento para SEM que pueden producir artefactos que interfieren con la preservación de la ultraestructura (Figura 2). Pérdida de fenestraciones ('defenestration') y la contracción fenestración puede ocurrir como resultado de una mala fijación, lo que resulta en una reducción de diámetro fenestración y la porosidad de la célula. Métodos para mejorar la conservación de muestras para el análisis SEM se han descrito anteriormente 15-17 y se discuteaquí con consejos adicionales sobre cómo mejorar la conservación de muestras. Los principales objetivos de la conservación de muestras son para eliminar la sangre de los sinusoides de modo que la superficie de la CESH puede ser visualizada y para evitar daños CESH de cualquiera alta presión o retrasada de fijación. La perfusión del hígado entero de fijador a través de la vena portal es el método preferido para la fijación de hígado. Como se describe en detalle en otra parte 16,18 perfusión debe llevarse a cabo a baja presión (por ejemplo 10 cm de H 2 0) para evitar artefactos relacionados con la presión de perfusión-y el daño al CESH, típicamente manifiestan como grandes lagunas dentro de la membrana celular. Sin embargo, la fijación razonable a menudo se puede obtener usando la perfusión de la aguja de biopsias de hígado de seres humanos y animales, como se describe en detalle en otra parte 19. Esta técnica consiste en inyectar directamente fijador en el tejido hasta que la sangre es expulsado de la muestra y el tejido es firme y fija. Fijación de muestras para microscopía electrónica necesita ser perfORMED lo más rápidamente posible después del cese del flujo sanguíneo para evitar cambios ultraestructurales que ocurren como resultado de los hígados procesos autolíticos extremadamente rápidos.
También presentamos un método de análisis de imagen que minimiza la inclusión de artefactos, y normaliza la medición de fenestraciones. La variación en la selección de sinusoides para micrografías, análisis de imágenes de artefactos, y la medición de área de la célula para la porosidad y la fenestración frecuencia han dado lugar a grandes discrepancias en los resultados publicados. Un enfoque estandarizado para la evaluación y medición de fenestraciones y los requisitos mínimos para la presentación de los datos no se han abordado con claridad en la literatura previamente 4,10,20-31.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacidad de medir con precisión y de manera reproducible el estado del hígado endotelio sinusoidal es un paso importante en la comprensión de la biología de estas células altamente especializadas. Las nuevas técnicas como la microscopía iluminación estructurada 32, microscopía de fuerza atómica y 33 d-STORM (estocástico óptica directa reconstrución Microscopy) 34 impartirán información importante sobre la morfología de estas células in vitro, pero SEM sigue …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of material | Company | Catalogue Number | Comments |
| EM grade Glutaraldehyde | ProSciTech | C001 | Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze |
| Paraformaldehyde powder | Sigma Aldrich | 158127 | Always prepare Paraformaldehyde fresh |
| Sodium Cacodylate powder | Sigma Aldrich | C0250 | Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016 | Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O |
| Osmium tretroxide | ProSciTech | C011 | Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle |
| Ethanol- Absolute | Sigma Aldrich | 459836 | 100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve |
| Other grades of Ethanol | Labtech | EL5 | Prepare graded Ethanols with dH2O |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 52619 | Allow to reach room temperature before use |
| Cannulas | Terumo | TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C | 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice |
| Conductive Carbon tape | ProSciTech | IA0201 | |
| Carbon Paint | ProSciTech | I003 | |
| Ketamine | Must be optained under licence | ||
| Xylazine | Must be obtained under licence | ||
| Molecular Sieve | Sigma Aldrich | 208647 | Removes water from the 100 % Ethanol |
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