Ilt-Glucose afsavn og reoxygenering som en<em> In vitro</em> Iskæmireperfusion Skade Model for studere blod-hjerne barrieren dysfunktion
Summary
Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.
Abstract
Iskæmireperfusion (IR) skade er kendt for at bidrage væsentligt til den sygelighed og dødelighed forbundet med iskæmisk slagtilfælde. Iskæmiske cerebrovaskulære hændelser udgør 80% af alle slagtilfælde. En almindelig årsag til IR skade er den hurtige indstrømning af fluider efter en akut / kronisk okklusion af blod, næringsstoffer, ilt til vævet udløser dannelsen af frie radikaler.
Iskæmisk slagtilfælde efterfølges af blod-hjerne-barrieren (BBB) dysfunktion og vasogent hjerneødem. Strukturelt tight junctions (TJs) mellem endotelceller spiller en vigtig rolle i opretholdelse af integriteten af blod-hjerne-barrieren (BBB). IR skade er en tidlig sekundær skade, der fører til en ikke-specifik, inflammatoriske respons. Oxidativ og metabolisk stress efter inflammation udløser sekundær hjerneskade herunder BBB permeabilitet og afbrydelse af tight junction (TJ) integritet.
Vores protokol viser en in vitro </ Em> eksempel på oxygen-glucose deprivation og reoxygenering (OGD-R) på rottehjerne endotelcelle TJ integritet og stress fiberdannelse. I øjeblikket er flere eksperimentelle in vivo modeller anvendt til at undersøge effekten af IR skade; men de har flere begrænsninger, såsom de tekniske udfordringer i at udføre operationer, gen afhængige molekylære indflydelser og svært ved at studere mekanistiske relationer. Imidlertid kan in vitro-modeller hjælpe med at overvinde mange af disse begrænsninger. Den præsenterede protokol kan bruges til at undersøge de forskellige molekylære mekanismer og mekanistiske relationer for at tilvejebringe potentielle terapeutiske strategier. Resultaterne af in vitro-undersøgelser, kan imidlertid afvige fra standard in vivo-undersøgelser og bør fortolkes med forsigtighed.
Introduction
Iskæmireperfusion (IR) skade viser sig at være den hyppige årsag til forskellige svækkende komplikationer og dødsfald i forbindelse med slagtilfælde, myokardieinfarkt, traumer, perifer vaskulær sygdom og traumatisk hjerneskade 1,2. IR skade i cerebrale kar er en tidlig sekundær skade, der fører til inflammation og ødem 3. En af de alvorlige komplikationer, der opstår som et resultat af oxidativ og metabolisk stress efter inflammation er tab af homeostatiske balance fører til dannelse af frie radikaler, ændringer i blod-hjerne-barrieren (BBB) tight junctions (TJs) og mikrovaskulær permeabilitet 4,5.
Øjeblikket, in vivo modeller, der anvendes til at undersøge virkningerne af IR skade på BBB omfatter mellem-cerebral arterieokklusion (MCAO), mikroembolisme, og transgene eller knockout dyr. Men hver har sine ulemper og begrænsninger, som diskuteret af Hossmann 6. MCAO model anvendes til at studere effekts af redox stress, ændringer i forbindelsesepitoper kommunikation BBB og samspillet mellem hjerne og immunceller. Men de præsenterer forskellige tekniske udfordringer såsom behovet for præcise mikrokirurgiske procedurer og de vanskeligheder, deri. Mikroembolisme går nedbryder BBB mens anvendelsen af transgene eller knockout dyr at studere cerebral iskæmi kan have udfordringer som gen-afhængige molekylære påvirkninger af infarkt dannelse, ændringer i vaskulær anatomi og variation i legemsvægt 6. Derfor har in vitro modeller af iskæmi fundet stigende interesse i den seneste tid primært på grund af deres anvendelighed i udførelsen mekanistiske undersøgelser for narkotika. Imidlertid kan resultaterne af in vitro-undersøgelser ikke helt udgør en in vivo-undersøgelse, og skal fortolkes med forsigtighed 6.
Modsatrettede effekt af lave koncentrationer oxygen på endotheliale cellemonolag og mikrovaskulær permeabilitet har væretstuderet af Ogawa 7. Rottehjerne mikrovaskulære endotelceller (RBMECs) blev anvendt til at udvikle in vitro BBB. Den ilt-glucose afsavn og reoxygenering (OGD-R) teknik præsenteres i denne protokol er blevet tilpasset fra undersøgelser af Zulueta et al og Zhu et al 8,9. Vi udsat hjerne endotelceller til OGD-R ved at placere dem i en hypoxi / anoxi kammer indeholdende 0% O2, 5% CO2 og 95% N2. Celler blev senere vurderet for ændringer i TJ integritet og stress fiberdannelse ved hjælp immunfluorescens lokalisering og rhodamin phalloidin mærkning henholdsvis. Immunofluorescens-farvning for zonula occludens-1 (ZO-1) udføres for at bestemme TJ integritet, som ZO-1 er en vigtig stilladser membranbundet TJ protein. Rhodamin Phalloidin mærkning bestemmer filamentøse actin (f-actin) i cellen cytoskelettet og er en klar indikation af actin stress fiber dannelse i endotelceller.
<p class = "jove_content"> Målet med denne fremgangsmåde er at give indsigt i udviklingen OGD-R som en in vitro-IR model til undersøgelse BBB endotelcelle TJ integritet og f-actin stress fiberdannelse. Resultaterne vil give oplysninger om skæbne TJ protein, ZO-1 og stress fiber dannelse efter OGD-R. Forståelsen af disse forbindelser vil give mulighed for at bestemme de underliggende molekylære mekanismer, der udløses efter OGD-R og udvikle potentielle terapeutiske strategier for at forbedre BBB afbrydelse efter OGD-R behandling.Protocol
Representative Results
Discussion
OGD-R som en in vitro model for iskæmi-reperfusionsskade er blevet godt etableret til undersøgelse neuroner 10,11. Der er også undersøgelser, der viser effekten af OGD på hjernens endotelceller og ændringer i permeabilitet og TJ integritet 9. Vores undersøgelse viser imidlertid virkningen af OGD samt reoxygenering, som er nærmere repræsentation af iskæmisk reperfusionsskade i in vivo-betingelser, der opstår efter iskæmisk slagtilfælde.
Hyp…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender Scott og White Hospital Research Grants Program for finansiel støtte og Texas A & M Health Science Center College of Medicine Integreret Imaging laboratorium for brug af konfokal laser mikroskop. Vi anerkender Mr. Glen Cryer for hjælp med manuskript redigering.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
Referências
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
