Zuurstof-Glucose beroving en reoxygenatie als een<em> In Vitro</em> Ischemie-reperfusie letsel model voor de studie bloed-hersenbarrière Dysfunction
Summary
Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.
Abstract
Ischemie-reperfusie (IR) letsel is bekend dat het een belangrijke bijdrage leveren aan de morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met ischemische beroerte. Ischemische cerebrovasculaire accidenten zijn goed voor 80% van alle beroertes. Een veelvoorkomende oorzaak van IR schade is de snelle instroming van fluïda na een acute / chronische occlusie van bloed, voedingsstoffen, zuurstof aan het weefsel triggering de vorming van vrije radicalen.
Ischemische beroerte wordt gevolgd door de bloed-hersenbarrière (BBB) dysfunctie en vasogeen hersenoedeem. Structureel tight junctions (TJS) tussen de endotheelcellen spelen een belangrijke rol bij het handhaven van de integriteit van de bloed-hersenbarrière (BBB). IR letsel is een vroege secondaire verwonding leidt tot een niet-specifieke, inflammatoire reactie. Oxidatieve en metabole stress na ontsteking veroorzaakt secundaire hersenschade waaronder BBB permeabiliteit en verstoring van de tight junction (TJ) integriteit.
Ons protocol presenteert een in vitro </ Em> voorbeeld van zuurstof-glucose deprivatie en reoxygenatie (OGD-R) op de hersenen van de rat endotheelcellen TJ integriteit en de vorming van stress vezels. Tegenwoordig worden meerdere in vivo experimentele modellen worden gebruikt om de effecten van IR letsel te onderzoeken; maar ze hebben verschillende beperkingen, zoals de technische problemen bij het uitvoeren van operaties, gen afhankelijke moleculaire invloeden en moeilijkheden bij het bestuderen mechanistische relaties. Toch kan in vitro modellen helpen overwinnen veel van deze beperkingen. Het gepresenteerde protocol kan worden gebruikt om de verschillende moleculaire mechanismen en mechanistische relaties bestuderen potentiële therapeutische strategieën. Echter, de resultaten van in vitro studies verschillen van de standaard in vivo studies en moeten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd.
Introduction
Ischemie-reperfusie (IR) schade blijkt de frequente oorzaak van verschillende verzwakkende complicaties en sterfte geassocieerd met beroerte, myocardiaal infarct, trauma, perifere vaatziekte en hersentrauma 1,2 zijn. IR letsel in hersenvaten is een vroege secundaire verwonding leidt tot ontsteking en oedeem 3. Eén van de ernstige complicaties die optreedt als gevolg van oxidatieve en metabole stress na ontsteking verlies van homeostatische balans wat leidt tot vorming van vrije radicalen, veranderingen in de bloed-hersenbarrière (BBB) tight junctions (TJS) en microvasculaire permeabiliteit 4,5.
Momenteel in vivo modellen gebruikt om de effecten van IR schade aan de BBB studie omvatten middelste cerebrale arterie occlusie (MCAO), micro-embolie, en transgene en knockout dieren. Echter, elk heeft zijn nadelen en beperkingen zoals besproken door Hossmann 6. MCAO model wordt gebruikt om de effec bestuderents van redox stress, veranderingen in junctionele mededelingen van de BBB en de interacties tussen de hersenen en immuuncellen. Echter, presenteren zij diverse technische uitdagingen zoals de noodzaak voor nauwkeurige microchirurgische procedures en de moeilijkheden daarin. Micro-embolie breekt ogenblikkelijk beneden de BBB, terwijl het gebruik van transgene of knockout dieren cerebrale ischemie studeren uitdagingen zoals gen-afhankelijke moleculaire invloeden op infarct vorming, veranderingen in vasculaire anatomie en wisselende lichaamsgewicht 6 kunnen hebben. Vandaar dat in vitro modellen van ischémie gevonden toenemende belangstelling laatste tijd voornamelijk vanwege hun toepasbaarheid bij het uitvoeren mechanistische studies drugs. Echter, de resultaten van in vitro studies kunnen niet volledig een in vivo onderzoek vertegenwoordigen en moeten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd 6.
Tegenwerkende effect van lage zuurstofconcentraties op endotheliale celmonolagen en microvasculaire doorlaatbaarheid geweestbestudeerd door Ogawa 7. Rattenhersenen microvasculaire endotheelcellen (RBMECs) werden gebruikt om de in vitro BBB ontwikkelen. De zuurstof-glucose deprivatie en reoxygenatie (OGD-R) techniek in dit protocol is aangepast van studies van Zulueta et al en Zhu et al 8,9. We blootgestelde hersenen endotheelcellen OGD-R door ze in een hypoxia / anoxia cupje met 0% O2, 5% CO2 en 95% N2. De cellen werden later onderzocht op veranderingen in TJ integriteit en stress vezelvorming middels respectievelijk immunofluorescentie lokalisatie en rhodamine phalloidin labeling. Immunofluorescentie kleuring voor zonula-occludens 1 (ZO-1) wordt uitgevoerd TJ integriteit te geven, aangezien ZO-1 is een belangrijke scaffolding membraangebonden TJ eiwit. Rhodamine Phalloidin labeling bepaalt de filamenteus actine (F-actine) in de cel cytoskelet en is een duidelijke indicatie van actine spanning vezelvorming in endotheelcellen.
<p class = "jove_content"> Het doel van deze methode is om inzicht te geven in de ontwikkeling van OGD-R als een in vitro IR model voor het bestuderen van BBB endotheelcellen TJ integriteit en f-actine stress-fiber vorming. De resultaten zullen informatie verschaffen over het lot van TJ eiwit, ZO-1 en stress fiber vorming na OGD-R. Inzicht in deze relaties gelegenheid om de onderliggende moleculaire mechanismen die in werking treden na OGD-R te bepalen en potentiële therapeutische strategieën om de verstoring BBB volgende OGD-R behandeling te bevorderen ontwikkelen.Protocol
Representative Results
Discussion
OGD-R als een in vitro model voor ischemie-reperfusie schade is goed vastgesteld voor het bestuderen neuronen 10,11. Er zijn ook studies die het effect van OGD op de hersenen endotheelcellen en veranderingen in permeabiliteit en TJ integriteit 9. Echter, onze studie toont het effect van OGD en reoxygenatie, hetgeen nader weergave van ischemische reperfusieschade bij in vivo omstandigheden die na herseninfarct optreden.
Hypoxische-ischemische aandoening…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen Scott en White Ziekenhuis Research Grants Program voor financiële steun en de Texas A & M Health Science Center College of Medicine Geïntegreerde Imaging Laboratorium voor het gebruik van de confocale laser microscoop. Wij erkennen Mr Glen Cryer voor hulp bij manuscript uitgeven.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
Referências
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
