Oxygène-glucose privation et réoxygénation comme un<em> In Vitro</em> Ischémie-reperfusion modèle pour étudier la dysfonction barrière hémato-encéphalique
Summary
Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.
Abstract
Ischémie-reperfusion (IR) des blessures est connu pour contribuer de manière significative à la morbidité et de la mortalité associée à un accident ischémique cérébral. Accidents vasculaires cérébraux ischémiques représentent 80% de tous les accidents vasculaires cérébraux. Une cause fréquente de blessures IR est l'afflux rapide de liquides suite à une occlusion chronique / aiguë de sang, les nutriments, oxygène vers les tissus déclenchant la formation de radicaux libres.
L'AVC ischémique est suivie par barrière hémato-encéphalique (BHE) et la dysfonction vasogénique oedème cérébral. Structurellement, les jonctions serrées (TJS) entre les cellules endotheliales jouent un rôle important dans le maintien de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE). IR blessure est une blessure secondaire au début conduisant à une réponse inflammatoire non spécifique. Le stress oxydatif et l'inflammation métabolique suivante déclenche des dommages au cerveau secondaire comprenant perméabilité de la BHE et la perturbation des jonctions serrées (TJ) intégrité.
Notre protocole présente in vitro </ Em> exemple de la privation d'oxygène-glucose et réoxygénation (AM-R) sur des cellules de cerveau de rat endothéliale TJ intégrité et la formation de fibres de stress. Actuellement, plusieurs expérimentale dans des modèles in vivo sont utilisés pour étudier les effets des blessures IR; mais ils ont plusieurs limitations, telles que les difficultés techniques liées à des opérations chirurgicales, les influences moléculaires dépendantes de gènes et la difficulté à étudier les relations mécanistes. Cependant, les modèles in vitro peuvent aider à surmonter bon nombre de ces limitations. Le protocole présenté peut être utilisé pour étudier les différents mécanismes moléculaires et les relations mécaniques à fournir des stratégies thérapeutiques potentielles. Cependant, les résultats des études in vitro peuvent différer de la norme des études in vivo et doivent être interprétées avec prudence.
Introduction
Ischémie-reperfusion (IR) des blessures se trouve être la cause fréquente de diverses complications et de décès débilitants associés à l'AVC, infarctus du myocarde, un traumatisme, une maladie vasculaire périphérique et une lésion cérébrale traumatique 1,2. Blessures IR dans les vaisseaux cérébraux est une blessure secondaire au début conduisant à une inflammation et un oedème 3. Une des complications graves qui se produisent à la suite de stress oxydatif et l'inflammation métabolique qui suit est la perte de l'équilibre homéostatique conduisant à la formation de radicaux libres, des altérations de la barrière hémato-encéphalique (BHE) jonctions serrées (TJ) et la perméabilité microvasculaire 4,5.
Actuellement, des modèles in vivo utilisées pour étudier les effets des blessures IR sur le BBB inclure une occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAO), microembolies et transgéniques ou knock-out animaux. Cependant, chacun a ses inconvénients et limitations comme indiqué par Hossmann 6. Modèle MCAO est utilisée pour étudier l'effits de stress redox, changements dans les communications de jonction de la BHE et les interactions entre le cerveau et les cellules immunitaires. Cependant, ils présentent divers défis techniques tels que la nécessité de procédures de microchirurgie précis et les difficultés qui y sont. Microembolies rompt instantanément sur le BBB tandis que l'utilisation de transgéniques ou knock-out animaux pour étudier l'ischémie cérébrale peut avoir des défis tels que les influences génétiques moléculaires dépendant sur la formation de l'infarctus, les changements dans l'anatomie vasculaire et variabilité de poids corporel 6. Ainsi, des modèles in vitro d'ischémie ont trouvé un intérêt croissant ces derniers temps principalement en raison de leur applicabilité dans la réalisation d'études mécanistes pour les médicaments. Cependant, les résultats des études in vitro peuvent ne pas représenter pleinement une étude in vivo et doivent être interprétées avec prudence 6.
Réactives effet de faibles concentrations d'oxygène sur des monocouches de cellules endotheliales et la perméabilité microvasculaire étéétudié par Ogawa 7. Les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de rat (RBMECs) ont été utilisés pour développer in vitro du Bureau. La privation et la réoxygénation oxygène-glucose (OGD-R) technique présentée dans ce protocole a été adapté à partir d'études de Zulueta et al et Zhu et al 8,9. Nous avons exposé les cellules endotheliales du cerveau à OGD-R en les plaçant dans une chambre de l'hypoxie / anoxie contenant 0% O 2, 5% CO 2 et 95% de N 2. Les cellules ont ensuite été évalués pour des altérations de l'intégrité et le stress TJ formation de fibres par immunofluorescence localisation et la rhodamine étiquetage phalloidin respectivement. Immunofluorescence pour zonula occludens-1 (ZO-1) est effectuée pour déterminer l'intégrité TJ, comme ZO-1 est une membrane d'échafaudage importante protéine liée à TJ. Étiquetage rhodamine phalloïdine détermine l'actine filamenteuse (f actine) dans le cytosquelette de la cellule et est une indication claire de l'actine la formation de fibres de stress dans les cellules endothéliales.
<p class = "jove_content"> Le but de cette méthode est de donner un aperçu de l'élaboration OGD-R comme un modèle in vitro de IR pour étudier BBB intégrité de TJ de cellules endothéliales et la formation de fibres de stress f-actine. Les résultats fourniront des informations sur le sort de la protéine TJ, ZO-1 et la formation de fibres de stress suivant OGD-R. La compréhension de ces relations sera l'occasion de déterminer les mécanismes moléculaires sous-jacents qui sont déclenchés suivent OGD-R et développer des stratégies thérapeutiques potentielles pour améliorer la perturbation BBB après le traitement AMG-R.Protocol
Representative Results
Discussion
OGD-R comme un modèle in vitro pour les lésions d'ischémie-reperfusion a été bien établi pour étudier les neurones 10,11. Il existe également des études montrant l'effet de l'OGD sur les cellules et les modifications endothéliales cérébrales de la perméabilité et l'intégrité TJ 9. Cependant, notre étude montre l'effet de l'OGD ainsi que réoxygénation, qui est une représentation plus proche de lésions de reperfusion ischémique dans des …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons Scott et le Programme de subventions de recherche Hôpital Blanche pour un soutien financier et Texas A & M Health Science Center College de médecine de laboratoire intégré Imaging pour l'utilisation du microscope confocal à balayage laser. Nous reconnaissons M. Glen Cryer de l'aide pour l'édition de manuscrits.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
Referências
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