חמצן גלוקוז קיפוח וReoxygenation כ<em> במבחנה</em> איסכמיה reperfusion פציעת דגם לחוסר תפקוד מחסום דם-המוח לומד
Summary
Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.
Abstract
איסכמיה reperfusion פציעה (IR) ידועה לתרום באופן משמעותי לתחלואה ותמותה הקשורים בשבץ איסכמי. תאונות כלי דם במוח איסכמי מהוות 80% מכל מקרי השבץ. סיבה שכיחה לפגיעה IR היא הזרימה המהירה של נוזלים הבאים חסימה אקוטית / כרונית של דם, חומרים מזינים, חמצן לרקמה מפעילה ההיווצרות של רדיקלים חופשיים.
שבץ איסכמי ואחריו מחסום דם-מוח בתפקוד (BBB) ובצקת מוחית vasogenic. מבחינה מבנית, צמתים הדוקים (TJS) בין תאי האנדותל ממלאים תפקיד חשוב בשמירה על שלמות מחסום דם-המוח (BBB). פציעת IR היא פגיעה משנית מוקדמת שהובילה לתגובה הלא ספציפית, דלקתית. חמצוני ולחץ מטבולים הבאים דלקת גורם לניזק מוחי המשני כוללים חדירות BBB ושיבוש צומת הדוקה יושר (TJ).
הפרוטוקול שלנו מציג במבחנה </ Em> דוגמא למחסור בחמצן גלוקוז וreoxygenation (OGD-R) בתא האנדותל מוח החולדה שלמות TJ והיווצרות מתח סיב. נכון לעכשיו, כמה ניסויים במודלי vivo משמשים כדי לחקור את ההשפעות של פגיעת IR; עם זאת יש להם כמה מגבלות, כגון אתגרים הטכניים בביצוע ניתוחים, השפעות מולקולריות תלויות גן וקושי בלימוד יחסים מכניסטית. עם זאת, במבחנה מודלים עשויים לסייע בהתגברות על מגבלות רבות של אלה. הפרוטוקול שהוצג יכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים מולקולריים השונים ומערכות יחסים מכניסטית לספק אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות. עם זאת, התוצאות של מחקרים במבחנה עשויות להיות שונות מרגילות במחקרי vivo ויש לפרש בזהירות.
Introduction
איסכמיה reperfusion פציעה (IR) נמצאת להיות הסיבה השכיחה לסיבוכים שונים מתישים ומקרי מוות הקשורים לאירוע מוחי, אוטם שריר לב, טראומה, מחלת כלי דם היקפית ופגיעה מוחית טראומטית 1,2. פציעת IR בכלי מוח היא פגיעה משנית מוקדמת וגורמת לדלקת ובצקת 3. אחד הסיבוכים החמורים המתרחשים כתוצאה מחמצון ולחץ מטבולים הבאים דלקת הוא אובדן שיווי משקל homeostatic המוביל להיווצרות של רדיקלים חופשיים, שינויים במחסום דם-המוח (BBB) צמתים הדוקים (TJS) וחדירות כלי דם 4,5.
נכון לעכשיו, במודלי vivo משמשים כדי לחקור את ההשפעות של פגיעת IR על BBB כוללים עורקים התיכון ספיגה מוחין (MCAO), microembolism, ובעלי חיים מהונדסים או נוק אאוט. עם זאת, לכל אחד יש חסרונות ומגבלות שלה כפי שפורט על ידי Hossmann 6. מודל MCAO משמש ללמוד effecTS של מתח חיזור, שינויים בתקשורת junctional של BBB ויחסי הגומלין בין המוח ותאי חיסון. עם זאת, הם מציגים אתגרים טכניים שונים כגון צורך בנהלים מדויקים מייקר והקשיים בהם. Microembolism שובר באופן מיידי את BBB תוך שימוש בבעלי החיים מהונדסים או נוק אאוט ללמוד איסכמיה מוחית עשוי להיות אתגרים כמו השפעות גן תלוי מולקולריות על היווצרות אוטם, שינויים באנטומיה של כלי דם ומשקל גוף שונה 6. מכאן, במבחנה מודלים של איסכמיה שמצאו עניין גובר בתקופה האחרונה בעיקר בבגלל תחולתם בביצוע מחקרים מכניסטית לסמים. עם זאת, התוצאות של מחקרים במבחנה לא יכולות לייצג באופן מלא מחקר in vivo ויש לפרש בזהירות 6.
פעולה נוגדת של ריכוזי חמצן נמוכים בmonolayers תא אנדותל וחדירות כלי דם הייתהלמד על ידי 7 Ogawa. תאי כלי דם במוח חולדה אנדותל (RBMECs) שמשו לפיתוח במבחנה BBB. טכניקת המחסור בחמצן גלוקוז וreoxygenation (OGD-R) הוצגה בפרוטוקול זה הותאמה ממחקרים על ידי אל Zulueta et וג'ו ואח '8,9. אנו נחשפים לתאי אנדותל מוח לOGD-R על ידי הצבת אותם בתא היפוקסיה / אנוקסיה המכיל 0% O 2, 5% CO 2 ו -95% N 2. תאים מאוחר יותר נבדקו לשינויים במבנה סיבי יושרה ולחץ TJ באמצעות לוקליזציה immunofluorescence ותיוג phalloidin rhodamine בהתאמה. מכתים immunofluorescence לoccludens-1 zonula (ZO-1) מבוצע כדי לקבוע שלמות TJ, כZO-1 הוא קרום פיגומים חשוב מחויב חלבון TJ. תיוג Rhodamine Phalloidin קובע אקטין פילמנטיות (-actin ו) בשלד תא התא והוא אינדיקציה ברורה של היווצרות מתח סיב אקטין בתאי אנדותל.
<p class = "jove_content"> מטרתה של שיטה זו היא לספק תובנה פיתוח OGD-R כבמבחנת מודל IR ללימוד שלמות BBB תא האנדותל TJ והיווצרות מתח סיב F- אקטין. התוצאות תספק מידע על גורלו של חלבון TJ, ZO-1 והיווצרות מתח סיב הבא OGD-R. הבנת יחסים אלה מספקת הזדמנות כדי לקבוע את המנגנונים מולקולריים שבבסיס שמופעלים הבאים OGD-R ולפתח אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות כדי לשפר את ההפרעה BBB לאחר טיפול OGD-R.Protocol
Representative Results
Discussion
OGD-R כמודל במבחנה לפגיעה איסכמיה reperfusion כבר מבוסס היטב ללימוד נוירונים 10,11. ישנם גם מחקרים המראים את ההשפעה של OGD על תאי האנדותל מוח ושינויים בחדירות וTJ יושרה 9. עם זאת, המחקר שלנו מראה את ההשפעה של OGD כמו גם reoxygenation, אשר היא ייצוג קרוב של פגיעת reperfusion איסכמ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים סקוט ולבן בית החולים תכנית מענקי מחקר לתמיכה כספית וטקסס A & M למדעי בריאות מרכז מכללה למעבדת הדמיה רפואה משולבת לשימוש במיקרוסקופ לייזר confocal. אנו מכירים מר גלן קרייר לעזרה עם עריכת כתב יד.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
Referências
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
