Oxigênio-Glucose Privação e reoxigenação como um<em> In Vitro</em> Isquemia e reperfusão Lesão modelo para estudar Disfunção Barreira Hematoencefálica
Summary
Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.
Abstract
Isquemia e reperfusão (IR) lesão é conhecido por contribuir significativamente para a morbidade e mortalidade associadas com acidentes vasculares cerebrais isquêmicos. Acidentes vasculares cerebrais isquêmicos são responsáveis por 80% de todos os acidentes vasculares cerebrais. Uma causa comum de lesão de IR é o rápido ingresso de fluidos após uma oclusão crónica / aguda de sangue, os nutrientes, oxigénio ao tecido provocando a formação de radicais livres.
Acidente vascular cerebral isquémico é seguido pela barreira sangue-cérebro (BBB) e disfunção vasogénico edema cerebral. Estruturalmente, as junções apertadas (TJS) entre as células endoteliais desempenham um papel importante na manutenção da integridade da barreira sangue-cérebro (BBB). IR lesão é uma lesão secundária precoce conduz a uma resposta não específica, inflamatória. Estresse oxidativo e inflamação metabólica seguinte desencadeia dano cerebral secundário, incluindo a certificação permeabilidade e perturbação da junção apertado integridade (TJ).
Nosso protocolo apresenta in vitro </ Em> exemplo de privação de oxigênio-glucose e reoxigenação (OGD-R) em células endoteliais cérebro de rato integridade TJ e formação de fibras de stress. Actualmente, vários experimental em modelos in vivo são utilizados para estudar os efeitos da lesão de IR; no entanto eles têm várias limitações, como os desafios técnicos na realização de cirurgias, gene influências moleculares dependentes e dificuldade em estudar as relações mecanicistas. No entanto, em modelos in vitro pode ajudar a superar muitas destas limitações. O protocolo apresentado pode ser usado para estudar os mecanismos moleculares e várias relações mecanísticos para proporcionar potenciais estratégias terapêuticas. No entanto, os resultados de estudos in vitro pode ser diferente da padrão em estudos in vivo e deve ser interpretado com cautela.
Introduction
A isquemia-reperfusão (IR) é encontrada lesão a ser a causa frequente de diversas complicações debilitantes e mortes associadas com acidente vascular cerebral, enfarte do miocárdio, trauma, doença vascular periférica e lesão cerebral traumática 1,2. IR lesão em vasos cerebrais é uma lesão secundária precoce levando a inflamação e edema 3. Uma das complicações graves que ocorrem como um resultado de stress oxidativo e metabólica seguinte inflamação é a perda de equilíbrio homeostático que conduz à formação de radicais livres, alterações na barreira sangue-cérebro (BBB) junções apertadas (TJs) e permeabilidade microvascular 4,5.
Actualmente, em modelos in vivo utilizados para estudar os efeitos do dano por IR na certificação incluem a oclusão da artéria cerebral média (MCAO), microembolia, e animais transgénicos ou knockout. No entanto, cada um tem os seus inconvenientes e limitações como discutido por Hossmann 6. Modelo MCAO é usado para estudar o effecst de estresse redox, mudanças nas comunicações de junção da certificação e as interações entre o cérebro e as células do sistema imunológico. No entanto, eles apresentam vários desafios técnicos, tais como a necessidade de procedimentos microcirúrgicos precisas e as dificuldades das mesmas. Microembolismo instantaneamente quebra da BBB, enquanto o uso de animais transgénicos ou knockout para estudar a isquemia cerebral pode ter desafios como influências dependente de genes moleculares na formação de enfarte, alterações na anatomia vascular e diferentes pesos corporais 6. Portanto, modelos in vitro de isquemia ter encontrado um interesse crescente nos últimos tempos, principalmente devido à sua aplicabilidade na realização de estudos sobre os mecanismos de drogas. No entanto, os resultados de estudos in vitro podem não representar plenamente um estudo in vivo e deve ser interpretado com cautela 6.
Counteractive efeito de baixas concentrações de oxigênio em monocamadas de células endoteliais e de permeabilidade microvascular ter sidoestudados por Ogawa 7. Células endoteliais microvasculares cérebro de rato (RBMECs) foram utilizados para desenvolver in vitro a certificação. A privação de oxigênio-glucose e reoxigenação técnica (OGD-R) apresentado neste protocolo foi adaptado de estudos de Zulueta et al e Zhu et al 8,9. Nós expostas células endoteliais cerebrais a OGD-R, colocando-os numa câmara de hipoxia / anoxia contendo 0% de O2, 5% de CO 2 e 95% de N2. As células foram depois avaliadas para alterações na integridade e formação de fibras de stress TJ usando localização imunofluorescência e marcação com rodamina-faloidina respectivamente. Imunofluorescência para zonula occludens-1 (ZO-1) é realizada para determinar a integridade TJ, como ZO-1 é um importante membrana andaimes proteína ligada TJ. Rotulagem rodamina faloidina determina a actina filamentosa (F-actina) no citoesqueleto da célula e é uma clara indicação de formação de fibras de stress de actina em células endoteliais.
<p class = "jove_content"> O objetivo deste método é fornecer uma visão sobre o desenvolvimento de OGD-R como um modelo no IR vitro para estudar a certificação células endoteliais integridade TJ e formação de fibras de stress f-actina. Os resultados irão fornecer informações sobre o destino de proteína TJ, ZO-1 e formação de fibras de stress seguinte OGD-R. Compreender essas relações será uma oportunidade para determinar os mecanismos moleculares subjacentes que são acionados seguintes OGD-R e desenvolver potenciais estratégias terapêuticas para melhorar a interrupção certificação após o tratamento OGD-R.Protocol
Representative Results
Discussion
OGD-R como um modelo in vitro para a lesão de isquemia-reperfusão tem sido bem estabelecido para o estudo de neurónios 10,11. Existem também estudos que mostram o efeito de OGD em células endoteliais cerebrais e alterações na permeabilidade e TJ integridade 9. No entanto, o nosso estudo mostra o efeito de OGD, bem como reoxigenação, que é uma representação mais próxima da lesão de reperfusão isquémica em condições in vivo que ocorrem após acidente vascular cereb…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos Scott and White Hospital Auxílio à Pesquisa Programa de apoio financeiro e Texas A & M Health Science Center College of Medicine Laboratório Integrado Imaging para o uso do microscópio confocal a laser. Reconhecemos o Sr. Glen Cryer para obter ajuda com a edição do manuscrito.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
Referências
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