Oxígeno-Glucosa Privación y Reoxigenación como<em> In Vitro</em> La isquemia-reperfusión modelo para el estudio de la disfunción barrera hematoencefálica
Summary
Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.
Abstract
La isquemia-reperfusión (IR) lesión se sabe que contribuyen significativamente a la morbilidad y la mortalidad asociadas con accidentes cerebrovasculares isquémicos. Accidentes cerebrovasculares isquémicos representan el 80% de todos los accidentes cerebrovasculares. Una causa común de lesión IR es el rápido flujo de entrada de fluidos después de una oclusión crónica / aguda de sangre, nutrientes, oxígeno al tejido desencadenar la formación de radicales libres.
El ictus isquémico es seguido por la barrera hematoencefálica (BBB) y la disfunción edema cerebral vasogénico. Estructuralmente, las uniones estrechas (TJS) entre las células endoteliales juegan un papel importante en el mantenimiento de la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB). IR lesión es una lesión secundaria temprana que conduce a una respuesta no específica, inflamatoria. Oxidativo y estrés metabólico después de la inflamación desencadena el daño cerebral secundario que incluye la acreditación de la permeabilidad y la interrupción de uniones estrechas (TJ) integridad.
Nuestro protocolo presenta in vitro </ Em> ejemplo de la privación de oxígeno y glucosa reoxigenación (OGD-R) en las células endoteliales de cerebro de rata integridad TJ y la formación de fibras de estrés. Actualmente, varios experimental pt modelos in vivo se utilizan para estudiar los efectos de la lesión IR; sin embargo, tienen varias limitaciones, como los desafíos técnicos en la realización de cirugías, gen influencias moleculares dependientes y dificultad en el estudio de las relaciones mecanicistas. Sin embargo, los modelos in vitro puede ayudar a superar muchas de esas limitaciones. El protocolo presentado puede ser usado para estudiar los diversos mecanismos moleculares y relaciones mecanicistas para proporcionar estrategias terapéuticas potenciales. Sin embargo, los resultados de los estudios in vitro pueden diferir de serie pt estudios in vivo y deben ser interpretados con cautela.
Introduction
-Isquemia-reperfusión (IR) lesión se encuentra que es la causa frecuente de diversas complicaciones debilitantes y muertes asociadas con el accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, trauma, enfermedad vascular periférica y lesión cerebral traumática 1,2. IR lesión en los vasos cerebrales es una lesión secundaria temprana conduce a la inflamación y el edema 3. Una de las complicaciones graves que se produce como resultado de estrés oxidativo y metabólica después de la inflamación es la pérdida de equilibrio homeostático conduce a la formación de radicales libres, alteraciones en la barrera hematoencefálica (BBB) uniones estrechas (TJs) y la permeabilidad microvascular 4,5.
Actualmente, pt modelos in vivo utilizados para estudiar los efectos de la lesión por IR en la BBB incluir oclusión de la arteria cerebral media (MCAO), microembolismo, y transgénicos o knockout animales. Sin embargo, cada uno tiene sus inconvenientes y limitaciones como se comenta por Hossmann 6. Modelo MCAO se utiliza para estudiar la effects de estrés redox, cambios en las comunicaciones de unión de la acreditación y las interacciones entre el cerebro y las células inmunes. Sin embargo, presentan varios desafíos técnicos, como la necesidad de procedimientos de microcirugía precisas y las dificultades en el mismo. Microembolismo instantáneamente rompe la acreditación mientras que el uso de transgénicos o knockout animales para estudiar la isquemia cerebral puede tener retos como influencias de genes dependientes moleculares sobre la formación del infarto, los cambios en la anatomía vascular y diferentes pesos corporales 6. Por lo tanto, los modelos in vitro de isquemia han encontrado un interés creciente en los últimos tiempos debido principalmente a su aplicabilidad en la realización de estudios mecanísticos de drogas. Sin embargo, los resultados de los estudios in vitro no pueden representar plenamente un estudio in vivo y deben ser interpretados con cautela 6.
Efecto contraproducente de bajas concentraciones de oxígeno en monocapas de células endoteliales y la permeabilidad microvascular haber sidoestudiado por Ogawa 7. Células endoteliales microvasculares de cerebro de rata (RBMECs) se utilizaron para desarrollar in vitro BBB. La técnica de la privación y la reoxigenación con oxígeno glucosa (OGD-R) se presenta en este protocolo ha sido adaptado de estudios de Zulueta y otros y Zhu et al 8,9. Se expuso células endoteliales cerebrales a OGD-R colocándolos en una cámara de hipoxia / anoxia que contiene 0% de O 2, 5% de CO 2 y 95% N 2. Las células fueron posteriormente evaluados por alteraciones en la formación de fibras integridad y el estrés TJ utilizando la localización de inmunofluorescencia y el etiquetado rodamina phalloidin respectivamente. La tinción de inmunofluorescencia para occludens-1 zonula (ZO-1) se realiza para determinar la integridad de TJ, como ZO-1 es una membrana andamios importante obligado proteínas TJ. Etiquetado rodamina faloidina determina la actina filamentosa (F-actina) en el citoesqueleto celular y es una clara indicación de la formación de fibras de estrés de actina en las células endoteliales.
<p class = "jove_content"> El objetivo de este método es para proporcionar una visión en el desarrollo de OGD-R como un modelo in vitro para el estudio de IR BBB células endoteliales integridad TJ y la formación de fibras de estrés de actina-f. Los resultados proporcionarán información sobre la suerte de proteínas TJ, ZO-1 y la formación de fibras de estrés después de la OGD-R. La comprensión de estas relaciones será una oportunidad para determinar los mecanismos moleculares subyacentes que se activan siguiendo OGD-R y desarrollar posibles estrategias terapéuticas para mejorar la interrupción acreditación después del tratamiento OGD-R.Protocol
Representative Results
Discussion
OGD-R como un modelo in vitro para la lesión por isquemia-reperfusión ha sido bien establecido para el estudio de las neuronas 10,11. También hay estudios que muestran el efecto de la OGD en las células endoteliales cerebrales y alteraciones en la permeabilidad y TJ integridad 9. Sin embargo, nuestro estudio muestra el efecto de OGD, así como la reoxigenación, que es una representación más cercana de la lesión por reperfusión isquémica en condiciones in vivo que se prod…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos Programa de Subvenciones del Hospital Blanca, Scott y de apoyo financiero y de Texas A & M Health Science Center College de Medicina de Laboratorio Integrado de imagen para el uso del microscopio láser confocal. Reconocemos el Sr. Glen Cryer para obtener ayuda con la edición de manuscritos.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
Referências
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
