Syre Glukos Deprivation och ny syresättning som en<em> In Vitro</em> Ischemi-reperfusion skada modell för att studera blodhjärnbarriären dysfunktion
Summary
Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.
Abstract
Ischemi-reperfusion (IR) skada är känd för att väsentligt bidra till sjuklighet och dödlighet i samband med ischemisk stroke. Ischemiska cerebrovaskulära olyckor står för 80% av alla slag. En vanlig orsak till IR-skada är den snabba inflödet av fluider efter en akut / kronisk tilltäppning av blod, näringsämnen, syre till vävnaden utlöser bildandet av fria radikaler.
Ischemisk stroke följs av blod-hjärnbarriären (BBB) dysfunktion och vasogent hjärnödem. Strukturellt tight junctions (TJs) mellan endotelcellerna spelar en viktig roll för att upprätthålla integriteten i blod-hjärnbarriären (BBB). IR-skada är en tidig sekundär skada som leder till ett icke-specifikt, inflammatoriskt svar. Oxidativ och metabolisk stress efter inflammation utlöser sekundära hjärnskador inklusive BBB permeabilitet och störningar av täta fogar (TJ) integritet.
Vår protokoll visar en in vitro </ Em> exempel på syre glukos deprivation och syresättningen (OGD-R) på råtthjärna endotelcell TJ integritet och stressfiberbildningen. För närvarande är flera experimentella in vivo-modeller som används för att studera effekterna av IR-skada; men de har flera begränsningar, såsom de tekniska utmaningarna i att utföra operationer, gen beroende molekylära influenser och svårigheter att studera mekanistiska relationer. Emellertid kan in vitro-modeller stöd för att övervinna många av dessa begränsningar. Den presenterade protokollet kan användas för att studera de olika molekylära mekanismer och mekanistiska relationer för att ge potentiella terapeutiska strategier. Dock kan resultaten av in vitro-studier skiljer sig från standard in vivo-studier och bör tolkas med försiktighet.
Introduction
Ischemi-reperfusion (IR) skada visar sig vara den vanligaste orsaken till olika försvagande komplikationer och dödsfall i samband med stroke, hjärtinfarkt, trauma, perifer kärlsjukdom och traumatisk hjärnskada 1,2. IR skada i cerebrala kärl är en tidig sekundär skada som leder till inflammation och ödem 3. En av de allvarliga komplikationer som uppstår som en följd av oxidativ och metabolisk stress efter inflammation är förlust av homeostatiska balansen som leder till bildning av fria radikaler, förändringar i blod-hjärnbarriären (BBB) tight junctions (TJs) och mikrovaskulär permeabilitet 4,5.
För närvarande in vivo-modeller som används för att studera effekterna av IR skada på BBB inkluderar mitten cerebral artärocklusion (MCAO), mikroemboli, och transgena eller knockout djur. Dock har varje sina nackdelar och begränsningar som diskuteras av Hossmann 6. MCAO modell används för att studera den effekts av redoxstress, förändringar i Junktional meddelanden från BBB och samspelet mellan hjärnan och immunceller. Men presenterar de olika tekniska utmaningar som behovet av precisa mikro förfaranden och de svårigheter däri. Mikroemboli bryter omedelbart ned BBB medan användningen av transgena eller knockout djur för att studera cerebral ischemi kan ha utmaningar som gen beroende molekylära påverkan på infarktbildning, förändringar i vaskulär anatomi och varierande kroppsvikt 6. Därför har in vitro modeller av ischemi hittades ökat intresse på senare tid främst på grund av deras användbarhet för att utföra mekanistiska studier för droger. Dock kan resultaten av in vitro-studier är helt representativ en in vivo-studie och måste tolkas med försiktighet 6.
Motverkande effekt av låga syrehalter på endotelceller cellmonoskikt och mikrovaskulär permeabilitet har varitstuderas av Ogawa 7. Råtthjäma mikrovaskulära endotelceller (RBMECs) användes för att utveckla in vitro BBB. Den syre glukos deprivation och syresättningen (OGD-R) teknik som presenteras i detta protokoll har anpassats från studier av Zulueta et al och Zhu et al 8,9. Vi exponerade hjärn endotelceller till OGD-R genom att placera dem i en hypoxi / anoxi kammare innehållande 0% O 2, 5% CO2 och 95% N2. Celler senare bedömas för förändringar i TJ integritet och stress fiberbildningen med hjälp av immunofluorescens lokalisering och rodamin falloidin märkning respektive. Immunofluorescens färgning för zonula occludens-1 (ZO-1) utförs för att bestämma TJ integritet, såsom ZO-1 är ett viktigt ställningsmembranbundet TJ-proteinet. Rodamin Phalloidin märkning bestämmer fintrådiga aktin (f-aktin) i cellen cytoskelettet och är en tydlig indikation på aktin stressen fiberbildning i endotelceller.
<p class = "jove_content"> Målet med denna metod är att ge insikt i att utveckla OGD-R som en in vitro IR modell för att studera BBB endotelceller TJ integritet och f-aktin stressen fiberbildningen. Resultaten kommer att ge information om vad som hänt TJ protein, ZO-1 och stress fiberbildning efter OGD-R. Att förstå dessa relationer kommer att ge en möjlighet att avgöra de underliggande molekylära mekanismer som utlöses efter OGD-R och utveckla potentiella terapeutiska strategier för att förbättra BBB störningar efter OGD-R behandling.Protocol
Representative Results
Discussion
OGD-R som en modell in vitro för ischemi-reperfusionsskada har väl etablerad för att studera nervceller 10,11. Det finns också studier som visar effekten av OGD på hjärn endotelceller och förändringar i permeabilitet och TJ integritet 9. Emellertid visar vår studie effekten av OGD liksom ny syresättning, vilket är en närmare representation av ischemisk reperfusionsskada i de vivo-betingelser som förekommer efter ischemisk stroke.
…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner Scott and White Hospital forskningsbidrag Program för ekonomiskt stöd och Texas A & M Health Science Center College of Medicine Integrerad Imaging Laboratory för användning av den konfokala lasermikroskop. Vi erkänner Mr Glen Cryer för att få hjälp med manus.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
Referências
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
